Forskrift om endring i forskrift om dyrehelsemessige betingelser for innførsel og utførsel av storfe.

I

I forskrift av 25. mars 2002 nr. 305 om dyrehelsemessige betingelser for innførsel og utførsel av storfe gjøres følgende endringer:

EØS-henvisningen i hjemmelsfeltet skal lyde:

Jf. EØS-avtalen vedlegg I kap. I direktiv 64/432/EØF (endret ved direktiv 90/423/EØF, direktiv 97/12/EF, direktiv 98/46/EF, direktiv 98/99/EF, direktiv 2000/20/EF, forordning (EF) nr. 535/2002, forordning (EF) nr. 1226/2002 og vedtak 2001/298/EF), direktiv 72/462/EØF (endret ved direktiv 89/227/EØF, direktiv 90/423/EØF, direktiv 91/69/EØF, direktiv 91/496/EØF og direktiv 91/688/EØF), vedtak 2000/330/EF (endret ved forordning (EF) nr. 535/2002), vedtak 2002/199/EF og ESA vedtak 74/94/COL.

Nytt kapittel IA skal lyde:

Forordning (EF) nr. 535/2002 av 21. mars 2002 om endringer i vedlegg C til direktiv 64/432/EØF, og om endringer i vedtak 2000/330/EF Forordning (EF) nr. 1226/2002 av 8. juli 2002 om endring av vedlegg B til rådsdirektiv 64/432/EØF.

Følgende forordninger tilføyes forskriften:

KOMMISJONEN FOR DE EUROPEISKE FELLESSKAP HAR –

under henvisning til traktaten om opprettelse av Det europeiske fellesskap,

under henvisning til rådsdirektiv 64/432/EØF av 26. juni 1964 om dyrehelseproblemer ved handel med storfe og svin innenfor Fellesskapet, 1 sist endret ved kommisjonsvedtak 2001/298/EF, 2 særlig artikkel 16 nr. 1 annet ledd, og

11. oktober 1999 vedtok Vitenskapskomiteen for dyrs helse og velferd en rapport 3 om endring av de tekniske vedleggene til direktiv 64/432/EØF for å ta hensyn til den vitenskapelige utviklingen vedrørende tuberkulose, brucellose og enzootisk bovin leukose. Ifølge ovennevnte rapport bør prøvene for brucellose foretas i samsvar med Manual of standards for Diagnostic Tests and Vaccines, tredje utgave, 1996, fra Det internasjonale kontor for epizootier (OIE). I august 2001 offentliggjorde OIE fjerde utgave, 2000, av denne håndboken som inneholder visse endringer i beskrivelsen av tester for brucellose. Vedlegg C til direktiv 64/432/EØF bør derfor endres for å fastsette testingsmetoder som skal gjelde ved overvåking og handel innenfor Fellesskapet, og som så langt det er mulig gjenspeiler OIE-standardene, men også tar hensyn til rådene fra Vitenskapskomiteen og fra medlemsstatenes nasjonale referanselaboratorier som samarbeider innenfor rammen av Den europeiske unions nettverk av nasjonale referanselaboratorier for brucellose. Kommisjonsvedtak 2000/330/EF av 18. april 2000 om godkjenning av tester for påvisning av antistoffer mot bovin brucellose innenfor rammen av rådsdirektiv 64/432/EØF 4 bør endres tilsvarende. Tiltakene fastsatt i denne forordning er i samsvar med uttalelse fra Den faste veterinærkomité –

1 EFT 121 av 29.7.1964, s. 1977/64.

2 EFT L 102 av 12.4.2001, s. 63.

3 SANCO/B3/R10/1999.

4 EFT L 114 av 13.5.2000, s. 37.

VEDTATT DENNE FORORDNING:

Artikkel 1

Vedlegg C til direktiv 64/432/EØF erstattes med vedlegget til denne forordning.

Artikkel 2

Artikkel 1 skal lyde: « Artikkel 1 Komplementbindingstester, bufret brucella-antigentester og ELISA-tester som foretas i samsvar med bestemmelsene i vedlegg C til direktiv 64/432/EØF, godkjennes med henblikk på utstedelse av et sertifikat.» Vedlegget oppheves.

Artikkel 3

Denne forordning trer i kraft den tjuende dag etter at den er kunngjort i De Europeiske Fellesskaps Tidende .

Denne forordning er bindende i alle deler og kommer direkte til anvendelse i alle medlemsstater.

Utferdiget i Brussel, 21. mars 2002.

For Kommisjonen

David BYRNE

Medlem av Kommisjonen

VEDLEGG

«VEDLEGG C

BRUCELLOSE

IDENTIFIKASJON AV AGENS

Dersom det påvises organismer med brucellamorfologi i abortmateriale, vaginalutflod eller melk ved hjelp av modifisert syrefast eller immunspesifikk farging, er det overveiende sannsynlighet for brucellose, særlig dersom diagnosen støttes av serologiske tester.

Etter isolasjon bør mikroorganismer, arter og biovar identifiseres ved hjelp av lysering av bakterievirus og/eller oksydative stoffskifteundersøkelser, dyrkingskriterier og biokjemiske og serologiske kriterier.

Metodene og mediene som brukes, standardiseringen av disse og tolkingen av resultatene skal være i samsvar med OIEs Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, fjerde utgave, 2000, kapittel 2.3.1 (brucellose hos storfe), kapittel 2.4.2 (brucellose hos geit og sau) og kapittel 2.6.2 (brucellose hos svin).

IMMUNOLOGISKE TESTER

2.1 Standarder

Brucella abortus -biovar 1 Weybridge-stamme nr. 99 eller USDA-stamme 1119-3 skal brukes til framstilling av alle antigener som brukes i Rose Bengal-testen (RBT), serumagglutinasjonstesten (SAT), komplementbindingstesten (CFT) og melkeringtesten (MTR).

Standardreferanseserum for RBT, SAT, CFT og MRT er OIEs internasjonale standardreferanseserum (OIEISS) som tidligere ble kalt WHO annet internasjonale anti- Brucella abortus -serum (ISAbS).

OIEISS, OIEs svakt positive ELISA-standardserum (OIEELISA WP SS), OIEs sterkt positive ELISA-standardserum (OIEELISA SP SS), OIEs negative ELISA-standardserum (OIEELISA N SS).

Ovennevnte standardsera er tilgjengelige fra Veterinary Laboratories Agency (VLA), Weybridge, Det forente kongerike.

OIEISS, OIEELISA WP SS, OIEELISA SP SS og OIEELISA N SS er internasjonale primærstandarder som skal brukes til å etablere nasjonale sekundære referansestandarder («arbeidsstandarder») for hver prøve i de enkelte medlemsstatene.

2.2. Enzymmerket antistofftest (ELISA) eller andre immunbindingstester for påvisning av bovin brucellose i serum eller melk

Metoden som brukes og tolkingen av resultatene skal være godkjent i samsvar med prinsippene fastsatt i kapittel 1.1.3 i OIEs Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, fjerde utgave, 2000, og bør minst omfatte laboratorieundersøkelser og diagnostiske undersøkelser.

2.2.2. Standardisering av testen

en fortynning av OIEISS i forholdet 1:150 1 eller en fortynning av OIEELISA WP SS i forholdet 1:2 eller en fortynning av OIEELISA SP SS i forholdet 1:16 i et negativt serum (eller i en negativ serumblanding) skal gi en positiv reaksjon, en fortynning av OIEISS i forholdet 1:600 eller en fortynning av OIEELISA WP SS i forholdet 1:8 eller en fortynning av OIEELISA SP SS i forholdet 1:64 i et negativt serum (eller i en negativ serumblanding) skal gi en negativ reaksjon, OIEELISA N SS skal alltid gi en negativ reaksjon.

en fortynning av OIEISS i forholdet 1:150 eller en fortynning av OIEELISA WP SS i forholdet 1:2 eller en fortynning av OIEELISA SP SS i forholdet 1:16 i et negativt serum (eller i en negativ serumblanding) som igjen er fortynnet i negative sera med antallet prøver som inngår i blandingen, skal gi en positiv reaksjon, OIEELISA N SS skal alltid gi en negativ reaksjon, prøven skal være tilstrekkelig til å påvise infeksjon hos ett enkelt dyr i en gruppe dyr som serumprøvene i blandingen er tatt fra.

en fortynning av OIEISS i forholdet 1:1000 eller en fortynning av OIEELISA WP SS i forholdet 1:16 eller en fortynning av OIEELISA SP SS i forholdet 1:125 i et negativt serum (eller i en negativ serumblanding) som igjen er fortynnet i forholdet 1:10 i negativ melk, skal gi en positiv reaksjon, OIEELISA N SS i forholdet 1:10 i negativ melk skal alltid gi en negativ reaksjon, prøven skal være tilstrekkelig til å påvise infeksjon hos ett enkelt dyr i en gruppe dyr som melke- eller myseprøvene i blandingen er tatt fra.

2.2.3. Vilkår for bruk av ELISA-test for diagnostisering av bovin brucellose

Ved bruk av ovennevnte kalibreringsvilkår for ELISA-test på serumprøver, skal ELISA-testen diagnostisk være minst like følsom som RBT eller CFT, idet det tas hensyn til den epidemiologiske situasjonen som testen brukes i.

Ved bruk av ovennevnte kalibreringsvilkår for ELISA-tester på blandede melkeprøver, skal ELISA-testen diagnostisk være minst like følsom som MRT, idet det ikke bare tas hensyn til den epidemiologiske situasjonen, men også til de gjennomsnittlige og forventede ekstremer av husdyrholdsystemer.

Dersom ELISA-testen brukes med henblikk på utstedelse av et sertifikat i samsvar med artikkel 6 nr. 1, eller med henblikk på etablering og bevaring av en besetningsstatus i samsvar med vedlegg A del II nr. 10, skal serumprøvene blandes på en slik måte at prøvingsresultatene med sikkerhet kan spores tilbake til det enkelte dyr i blandingen. Eventuelle bekreftende prøver skal foretas på serumprøver fra enkeltdyr.

ELISA-tester kan brukes på en melkeprøve tatt fra melk som er samlet inn fra en driftsenhet der minst 30 % av kuene er i laktasjon. Dersom denne metoden brukes, skal det treffes tiltak for å sikre at prøvene som tas ut for undersøkelse, med sikkerhet kan spores tilbake til enkeltdyrene som melken stammer fra. Eventuelle bekreftende prøver skal foretas på serumprøver fra enkeltdyr.

2.3. Komplementbindingstest (CFT)

Antigenet består av en bakteriell suspensjon i fenol-saltløsning (NaCl 0,85 % (m/v) tilsatt 0,5 % (v/v) fenol) eller i en veronal bufferløsning. Antigenene kan leveres i konsentrert form, forutsatt at fortynningsfaktoren som skal brukes, er oppført på flaskens etikett. Antigenet skal oppbevares ved 4 °C og ikke fryses.

serum fra storfe: 56-60 °C i 30-50 minutter, serum fra svin: 60 °C i 30-50 minutter.

For å oppnå en riktig reaksjon på testmetoden, bør det brukes en komplementærdose som er større enn det minimum som er nødvendig til fullstendig hemolyse.

kontroll av serumets antikomplementære virkning, kontroll av antigenet, kontroll av de sensibiliserte røde blodlegemene, kontroll av komplementet, kontroll av følsomheten ved hjelp av et positivt serum når reaksjonen begynner, kontroll av reaksjonens spesifisitet ved hjelp av et negativt serum.

OIEISS inneholder 1 000 internasjonale CFT-enheter (ICFTU) per ml. Dersom OIEISS prøves etter en gitt metode, angis resultatet som en titer (T OIEISS ). Testresultatet for prøveserumet angitt som titer (T PRØVESERUM ) skal uttrykkes i ICFTU per ml. For å regne om en titer til ICFTU kan faktoren (F) som kreves for å omregne titeren for et ukjent prøveserum (T PRØVESERUM ) som er prøvd etter denne metoden, til ICFTU, finnes ved formelen: F = 1 000 × 1/T OIEISS

og innholdet av internasjonale CFT-enheter per ml prøveserum (CFT PRØVESERUM ) finnes ved formelen: ICFTU PRØVESERUM = F × T PRØVESERUM

Et serum som inneholder 20 ICFTU per ml eller mer, anses som positivt.

2.4. Melkeringtest (MRT)

Antigenet består av en bakteriell suspensjon i fenol-saltløsning (NaCl 0,85 % (m/v) tilsatt 0,5 % (v/v) fenol) farget med hematoxylin. Antigenet skal oppbevares ved 4 °C og ikke fryses.

Antigenets følsomhet skal standardiseres i forhold til OIEISS på en slik måte at antigenet gir en positiv reaksjon med en fortynning av OIEISS i forholdet 1:500 i negativ melk og en negativ reaksjon med en fortynning i forholdet 1:1 000.

Ringtesten skal foretas på prøver som er representative for innholdet av hvert melkespann eller innholdet i hver samletank fra driftsenheten.

Melkeprøvene må ikke ha vært frosset, oppvarmet eller ristet kraftig.

på en melkesøyle som er minst 25 mm høy, og med en melkemengde på 1 ml, som er tilsatt 0,03 ml eller 0,05 ml av et av de standardiserte, fargede antigenene, på en melkesøyle som er minst 25 mm høy, og med en melkemengde på 2 ml, som er tilsatt 0,05 ml av et av de standardiserte, fargede antigenene, på en melkemengde på 8 ml, som er tilsatt 0,08 ml av et av de standardiserte, fargede antigenene.

Blandingen av melk og antigener skal inkuberes ved 37 °C i 60 minutter sammen med positive og negative arbeidsstandarder. Inkubasjon i ytterligere 16-24 timer ved 4 °C øker testens følsomhet.

negativ reaksjon: melken er farget, fløten er avfarget, positiv reaksjon: melken og fløten er farget på samme måte, eller melken er avfarget og fløten er farget.

2.5. Rose Bengal-test (RBT)

Antigenet består av en bakteriell suspensjon i en bufret brucella-antigenløsning med en pH på 3,65 ± 0,05 farget med Rose Bengal-farge. Antigenet skal leveres klart til bruk og skal oppbevares ved 4 °C og ikke fryses.

Antigenet skal framstilles uten hensyn til cellekonsentrasjonen, men følsomheten skal standardiseres i forhold til OIEISS på en slik måte at antigenet gir en positiv reaksjon med en serumfortynning i forholdet 1:45 og en negativ reaksjon med en fortynning i forholdet 1:55.

serum (20-30 μl) blandes med en tilsvarende mengde antigen på en hvit eller emaljert plate slik at det dannes en flate med en diameter på omtrent to cm. Blandingen vippes lett i fire minutter ved romtemperatur og avleses deretter ved god belysning for agglutinasjon, en automatisert metode kan brukes, men den må ha minst samme følsomhet og være minst like nøyaktig som den manuelle metoden.

Enhver synlig reaksjon anses som positiv, med mindre det er ekstraordinær tørking i kantene.

Positive og negative arbeidsstandarder bør tas med i hver testserie.

2.6. Serumagglutinasjonstest (SAT)

Antigenet består av en bakteriell suspensjon i fenol-saltløsning (NaCl 0,85 % (m/v) tilsatt 0,5 % (v/v) fenol). Formaldehyd må ikke brukes.

Antigenene kan leveres i konsentrert form, forutsatt at fortynningsfaktoren som skal brukes, er oppført på flaskens etikett.

Antigensuspensjon kan tilsettes EDTA til en endelig brukskonsentrasjon på 5 mM for å redusere antallet falskt positive testresultater. Antigensuspensjonens pH justeres deretter på nytt til 7,2.

OIEISS inneholder 1 000 internasjonale agglutinasjonsenheter.

Antigenet skal framstilles uten hensyn til cellekonsentrasjonen, men følsomheten skal standardiseres i forhold til OIEISS på en slik måte at antigenet enten gir 50 % agglutinasjon med en endelig serumfortynning på mellom 1:600 og 1:1 000 eller 75 % agglutinasjon med en endelig serumfortynning på mellom 1:500 og 1:750.

Det kan også være tilrådelig å sammenligne reaktiviteten til nye og tidligere antigenserier ved hjelp av et panel av definerte sera.

Testen foretas enten i reagensglass eller på mikroplater. Blandingen av antigen og serumfortynninger skal inkuberes i 16-24 timer ved 37 °C.

Minst tre fortynninger skal tilberedes for hvert serum. Fortynninger av serum under mistanke skal lages på en slik måte at reaksjonen ved positivitetsgrensen avleses i det midterste reagensglasset (eller den midterste fordypningen på mikroplater).

Innholdet av brucella-agglutinasjon i et serum skal uttrykkes i IE per ml.

Et serum som inneholder 30 IE per ml eller mer, anses som positivt.

TILLEGGSPRØVER

3.1. Brucellose-intradermaltest (BST)

Brucellose-intradermaltesten skal ikke brukes med henblikk på utstedelse av et sertifikat for handel innenfor Fellesskapet. Brucellose-intradermaltesten er en av de mest spesifikke testene for påvisning av brucellose hos uvaksinerte dyr, men diagnosen bør ikke stilles bare på grunnlag av positive intradermale reaksjoner. Storfe som har reagert negativt på en av de serologiske testene definert i dette vedlegg, og som reagerer positivt på BST, anses som infisert. Storfe som har reagert positivt på en av de serologiske testene definert i dette vedlegg, kan gjennomgå en BST-test som støtte for tolkingen av resultatene av de serologiske testene, særlig dersom en kryssreaksjon med antistoffer mot andre bakterier ikke kan utelukkes i brucellosefrie eller offisielt brucellosefrie besetninger.

Testen skal foretas ved hjelp av et standardisert og definert brucellose-allergenpreparat som ikke inneholder glatt lipopolysakkarid-antigen (LPS), ettersom det kan framkalle uspesifikke betennelsesreaksjoner eller forstyrre senere serologiske tester.

Brucellin INRA er et slikt preparat som er framstilt av en ru B.melitensis -stamme. Framstillingskravene er beskrevet i del B2 i kapittel 2.4.2 i OIEs Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, fjerde utgave, 2000.

3.1.3. Testingsmetode

0,1 ml brucellose-allergen injiseres intradermalt i halefolden, flanken eller siden av halsen.

Prøven avleses etter 48-72 timer.

Hudtykkelsen på injeksjonsstedet måles med skyvelær før injeksjonen og ved den påfølgende undersøkelsen.

Tolking av resultatene:

Sterke reaksjoner gjenkjennes lett ved lokal hevelse og indurasjon.

En hudtykkelse på 1,5 til 2 mm anses som en positiv reaksjon på BST.

3.2. Kompetitiv ELISA-test (cELISA)

cELISA-testen skal ikke brukes med henblikk på utstedelse av et sertifikat for handel innenfor Fellesskapet. cELISA-testen har vist seg å være mer spesifikk enn for eksempel den indirekte ELISA-testen og kan derfor brukes som støtte for tolkingen av resultatene av de serologiske testene.

Testen skal foretas i samsvar med bestemmelsene i kapittel 2.3.1 nr. 2 bokstav a) i OIEs Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, fjerde utgave, 2000.

NASJONALE REFERANSELABORATORIER

godkjenning av resultatene av valideringsundersøkelsene som dokumenterer at testmetoden som brukes i medlemsstaten, er pålitelig, fastsettelse av høyeste antall prøver som kan samles i ELISA-testsettene som brukes i medlemsstaten, kalibrering av de nasjonale sekundære referansestandardseraene («arbeidsstandarder») i forhold til det internasjonale primærstandardserumet nevnt i nr. 2.1, kvalitetskontroll av alle antigener og partier av ELISA-testsett som brukes i medlemsstaten, samarbeid innenfor Den europeiske unions nettverk av nasjonale referanselaboratorier for brucellose.

BELGIA Centre d'etudes et de recherche vétérinaire et agrochimiques (CERVA/CODA) Groeselenberg 99 B-1180 Bruxelles DANMARK Danish Veterinary Institute Bulowsvej 27 DK-1790 Copenhagen TYSKLAND Bundesinstitut für Gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin (BGVV) Nationales Veterinärmedizinisches Referenzlabor für Brucellose Postfach 33 00 13 D-14191 Berlin HELLAS Veterinary Laboratory of Larissa Department of Microbiology 6th km of National Road Larissa-Trikala GR-4111 10 Larissa SPANIA Laboratorio Central de Veterinaria de Santa Fe Camino del Jau S/N E-18320 Santa Fe (Granada) FRANKRIKE Laboratoire national et OIE/FAO de référence pour la brucellose Agence française de sécurité sanitaire des aliments (AFSSA) BP 67 F-94703 Maisons-Alfort Cedex IRLAND Brucellosis Laboratory Model Farm Road Cork Irland ITALIA Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Abruzzo e del Molise Via Campo Boario I-64100 Teramo LUXEMBOURG State Laboratory for Veterinarian Medicine 54, avenue Gaston Diderich BP 2081 L-1020 Luxembourg NEDERLAND Centraal Instituut DierziekteControle CIDC-Lelystad Houtribweg 39 PO Box 2004 8203 AA Lelystad Nederland ØSTERRIKE Bundesanstalt für veterinärmedizinische Untersuchungen Robert-Koch-Gasse 17 A-2340 Modling PORTUGAL Laboratório Nacional de Investigação Veterinária (LNIV) Estrada de Benfica, n.° 701 P-1549-011 Lisboa FINLAND National Veterinary and Food Research Institute Hämeentie 57 PO Box 45 FIN-00581 Helsinki SVERIGE National Veterinary Institute S-751 89 Uppsala DET FORENTE KONGERIKE FAO/WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Brucellosis Veterinary Laboratories Agency New Haw Addlestone Surrey KT15 3NB United Kingdom Immunodiagnostics Department Veterinary Sciences Division Stoney Road Stormont Belfast BT4 3SD United Kingdom»

1 Fortynninger som brukes til å skape flytende reagenser uttrykkes i dette vedlegg som for eksempel 1:150, som betyr en fortynning på 1 til 150.

KOMMISJONEN FOR DE EUROPEISKE FELLESSKAP HAR –

under henvisning til traktaten om opprettelse av Det europeiske fellesskap,

under henvisning til rådsdirektiv 64/432/EØF av 26. juni 1964 om dyrehelseproblemer ved handel med storfe og svin innenfor Fellesskapet, 1 sist endret ved kommisjonsforordning (EF) nr. 535/2002, 2 særlig artikkel 16 nr. 1 andre ledd, og

11. oktober 1999 vedtok Vitenskapskomiteen for dyrs helse og velferd en rapport 3 om endring av de tekniske vedleggene til rådsdirektiv 64/432/EØF for å ta hensyn til den vitenskapelige utvikling innen tuberkulose, brucellose og enzootisk bovin leukose. Ifølge denne rapporten skal testene for tuberkulose utføres i samsvar med tredje utgave av Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines (1996-utgaven) fra Det internasjonale kontor for epizootier (OIE). I august 2001 utga OIE fjerde utgave av denne håndboken (2000-utgaven), som inneholder visse endringer når det gjelder beskrivelsen av testene for tuberkulose. I januar 2002 utga Det europeiske direktorat for legemiddelkvalitet fjerde utgave (2002-utgaven) av Den europeiske farmakopé, herunder monografiene 0535 og 0536 for renset proteinderivat av aviært tuberkulin og bovint tuberkulin. Det er derfor nødvendig å endre vedlegg B til direktiv 64/432/EØF slik at det fastsettes framgangsmåter for tester som gjelder med henblikk på overvåking og handel innenfor Fellesskapet, under hensyn til uttalelse fra Vitenskapskomiteen for veterinære spørsmål. Tiltakene fastsatt i denne forordning er i samsvar med uttalelse fra Den faste komité for næringsmiddelkjeden og dyrehelse –

1 EFT 121 av 29.7.1964, s. 1977/64.

2 EFT L 80 av 23.3.2002, s. 22.

3 SANCO/B3/R10/1999.

VEDTATT DENNE FORORDNING:

Artikkel 1

Vedlegg B til direktiv 64/432/EØF erstattes med vedlegget til denne forordning.

Artikkel 2

Denne forordning trer i kraft den tjuende dag etter at den er kunngjort i De Europeiske Fellesskaps Tidende .

Denne forordning er bindende i alle deler og kommer direkte til anvendelse i alle medlemsstater.

Utferdiget i Brussel, 8. juli 2002.

For Kommisjonen

David BYRNE

Medlem av Kommisjonen

VEDLEGG

« VEDLEGG B

TUBERKULOSE

IDENTIFISERING AV AGENS

Forekomst av Mycobacterium bovis (M. bovis) , agens for storfetuberkulose, i kliniske prøver og post mortem-prøver kan påvises ved undersøkelse av fargede utstrykspreparater eller immunoperoksidaseteknikker og bekreftes ved dyrking av organismen i primære isolasjonsmedier.

Patologisk materiale for bekreftelse av M. bovis bør tas fra unormale lymfeknuter og parenkymatøse organer som lunger, lever, milt osv. I tilfeller der dyret ikke har patologiske forandringer, bør det tas prøver fra retrofaryngeale lymfeknuter, bronkiale lymfeknuter, mediastinale lymfeknuter, supramammære lymfeknuter, kjevelymfeknuter og enkelte av mesenteriets lymfeknuter og leverens lymfeknuter med henblikk på undersøkelse og dyrking.

Identifisering av isolater kan vanligvis foretas ved å bestemme dyrkingsmessige og biokjemiske egenskaper. Polymerasekjedereaksjonen (PCR) kan også brukes til å oppdage M. tuberculosis -komplekset. DNA-analyseteknikker kan vise seg å være hurtigere og mer pålitelige enn biokjemiske metoder til å skille M. bovis fra andre medlemmer av M. tuberculosis -komplekset. Genetiske avtrykk gjør det mulig å skille mellom forskjellige stammer av M. bovis og vil gjøre det mulig å beskrive mønstre for opprinnelse, overføring og spredning av M. bovis .

De teknikker og medier som brukes, standardiseringen av dem og tolkingen av resultatene må være i samsvar med det som er angitt i kapittel 2.3.1 (bovin tuberkulose) i OIEs Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines (fjerde utgave, 2000).

INTRADERMAL TUBERKULINTEST

Renset proteinderivat av tuberkulin som oppfyller vilkårene fastsatt i nr. 2.1 skal brukes til å utføre offisiell intradermal tuberkulintest i samsvar med framgangsmåtene nevnt i nr. 2.2.

2.1. Standarder for tuberkulin (bovint og aviært)

Renset proteinderivat (PPD-tuberkulin, bovint eller aviært) er et preparat som framstilles av de varmebehandlede produktene av vekst og lysering av Mycobacterium bovis og Mycobacterium avium (etter hva som er aktuelt), som kan avsløre en forsinket overfølsomhet i et dyr som er sensibilisert overfor mikroorganismer av samme art.

Tuberkulinet lages av de vannløselige fraksjonene som tilberedes ved oppvarming i frittflytende damp og deretter filtrering av kulturer av M. bovis og M. avium (etter hva som er aktuelt) dyrket i et flytende syntetisk medium. Filtratets aktive fraksjon, som består hovedsakelig av protein, isoleres ved utfelling, vaskes og oppløses på nytt. Et antimikrobielt konserveringsmiddel som ikke forårsaker falske positive reaksjoner, som fenol, kan tilsettes. Det sterile sluttpreparatet, fritt for mykobakterier, fordeles aseptisk i sterile glassbeholdere sikret mot inngrep, som så lukkes for å hindre kontaminering. Preparatet kan frysetørkes.

Sprøyt inn flere graderte doser intrakutant på forskjellige steder i passende sensibiliserte albinomarsvin som hvert veier ikke mindre enn 250 g. Etter 24 – 28 timer framkommer reaksjoner i form av ødematøse hevelser med rødme av huden med eller uten nekrose i innsprøytingspunktene. Hvor store og alvorlige reaksjonene er, varierer med dosen. Usensibiliserte marsvin viser ingen reaksjoner på lignende innsprøytinger.

2.1.4. Tester

pH: pH-verdien er 6,5 – 7,5.

Fenol: Dersom preparatet som skal undersøkes, inneholder fenol, skal konsentrasjonen ikke være over 5 g/l.

Sensibiliserende virkning: Bruk en gruppe på tre marsvin som ikke er behandlet med noe materiale som vil forstyrre testen. Tre ganger med fem dagers mellomrom sprøytes en dose av preparatet som skal undersøkes, intrakutant inn i hvert marsvin med en dose tilsvarende 500 IE i 0,1 ml. 15 – 21 dager etter den tredje innsprøytingen sprøytes samme dose (500 IE) intrakutant inn i disse dyrene og i en kontrollgruppe med tre marsvin med samme vekt og som ikke tidligere har fått tuberkulininnsprøyting. 24 – 28 timer etter siste innsprøyting er reaksjonene hos de to gruppene ikke vesentlig forskjellige.

Giftighet: Bruk to marsvin som hvert veier ikke mindre enn 250 g og som ikke tidligere er behandlet med noe materiale som vil påvirke testen. Sprøyt intrakutant inn i hvert marsvin 0,5 ml av preparatet som skal undersøkes. Observer dyrene i sju dager. Ingen unormale virkninger forekommer i løpet av observasjonsperioden.

Sterilitet: Sterilitetsprøven bør utføres i samsvar med det som er fastsatt i monografien om vaksiner til veterinær bruk, fjerde utgave (2002), av Den europeiske farmakopé.

Styrken av det rensede proteinderivatet (bovint og aviært) bestemmes ved å sammenligne reaksjonene som framkalles i sensibiliserte marsvin av intrakutan innsprøyting av en rekke fortynninger av preparatet som skal undersøkes, med dem som framkalles av kjente konsentrasjoner av et referansepreparat av renset proteinderivat av tuberkulin (bovint eller eventuelt aviært) målt i internasjonale enheter.

For å prøve styrken, sensibiliseres minst ni albinomarsvin, som hvert veier 400 til 600 g, med dyp intramuskulær innsprøyting av 0,0001 mg våt masse av levende M. bovis av stammen AN5 oppslemmet i 0,5 ml av en løsning på 9 g/l med natriumklorid R for bovint tuberkulin, eller en passende dose inaktivt eller levende M. avium for aviært tuberkulin. Ikke mindre enn fire uker etter at marsvinene er sensibilisert, fjernes håret på flankene for å gi plass til minst fire innsprøytingssteder på hver side. Lag fortynninger av preparatet som skal undersøkes og av referansepreparatet ved å bruke en isotonisk fosfatbufret saltløsning (pH mellom 6,5 og 7,5) som inneholder 0,005 g/l polysorbat 80 R. Det brukes minst tre doser av referansepreparatet og minst tre doser av preparatet som skal undersøkes. Dosene velges slik at skadene som oppstår, har en diameter på ikke mindre enn 8 mm og ikke mer enn 25 mm. Fortynningene fordeles vilkårlig på stedene ved å bruke latinsk kvadratmønster. Hver dose sprøytes inn intrakutant i et konstant volum på 0,1 eller 0,2 ml. Etter 24 – 28 timer måles skadenes diameter, og resultatet av prøven beregnes ved å bruke de vanlige statistiske metodene og forutsette at skadenes diameter er direkte proporsjonal med logaritmen av konsentrasjonen av tuberkulinene.

Prøven er ikke gyldig med mindre pålitelighetsgrensene (P = 0,95) er over 50 % og under 200 % av den beregnede styrken. Den beregnede styrken er over 66 % og under 150 % av den oppgitte styrken for bovint tuberkulin. Den beregnede styrken er over 75 % og under 133 % av den oppgitte styrken for aviært tuberkulin. Den oppgitte styrken er over 20 000 IE/ml for begge tuberkuliner (bovint og aviært).

Beskyttes mot lys, ved en temperatur på 5 ± 3 °C.

styrken i internasjonale enheter per milliliter, navn på og mengde av tilsatte stoffer, for frysetørkede preparater: navn på og volum av den rekonstituerende væsken som skal tilsettes, at produktet bør brukes umiddelbart etter rekonstituering.

2.2. Framgangsmåte ved testing

enkel intradermal test: denne testen krever en enkelt innsprøyting av bovint tuberkulin, intradermal sammenlignende test: denne testen krever en innsprøyting av bovint tuberkulin og en innsprøyting av aviært tuberkulin foretatt samtidig.

ikke mindre enn 2000 IE bovint tuberkulin, ikke mindre enn 2000 IE aviært tuberkulin.

Volumet av hver innsprøyting skal ikke overstige 0,2 ml.

Tuberkulintester skal foretas ved at tuberkulin sprøytes inn i huden på halsen. Innsprøytingsstedene skal ligge i overgangen mellom halsens forreste og midterste tredel. Når både aviært og bovint tuberkulin sprøytes inn i samme dyr, skal innsprøytingsstedet for aviært tuberkulin ligge ca. 10 cm fra halskammen og innsprøytingsstedet for bovint tuberkulin ca. 12,5 cm lavere på en linje som er mer eller mindre parallell med skulderlinjen, eller stedene skal ligge på hver sin side av halsen. På unge dyr der det ikke er plass til å skille stedene tilstrekkelig på én side av halsen, skal en innsprøyting foretas på hver side av halsen på samme sted midt på halsens midterste tredel.

Teknikken for tuberkulintestene og tolking av resultatene er som følger:

Teknikk

Hårene skal fjernes på innsprøytingsstedet, og stedet skal renses. Innenfor hvert av de hårløse områdene skal en hudfold tas mellom pekefinger og tommelfinger og måles med krumpasser, og resultatet skal registreres. Tuberkulindosen skal så sprøytes inn med en metode som sikrer at tuberkulinet gis intrakutant. Det kan brukes en kort, steril kanyle med utvendig skråkant, påsatt en gradert sprøyte fylt med tuberkulin, som føres inn på skrå i hudens dypereliggende lag. Innsprøytingen er foretatt riktig dersom en liten erteaktig hevelse kan føles ved hvert innsprøytingssted. Hudfoldens tykkelse på hvert innsprøytingssted skal måles på nytt 72 timer (± 4 timer) etter innsprøytingen, og resultatet skal registreres.

Tolking av reaksjonene

Negativ reaksjon: dersom hevelsen bare er begrenset og ikke har økt hudfoldens tykkelse med mer enn 2 mm, og det ikke er kliniske tegn som diffust eller utbredt ødem, eksudasjon, nekrose, smerte eller betennelse i lymfekarene i dette området eller i lymfekjertlene. Tvilsom reaksjon: dersom det ikke konstateres kliniske tegn som nevnt i bokstav a), og dersom hudfoldens tykkelse har økt med 2 – 4 mm. Positiv reaksjon: dersom det konstateres kliniske tegn som nevnt i bokstav a), eller dersom hudfoldens tykkelse på innsprøytingsstedet har økt med mer enn 4 mm.

Offisielle intradermale tuberkulintester tolkes på følgende måte:

positiv: positiv reaksjon på bovint tuberkulin som definert i nr. 2.2.5.2 bokstav c), tvilsom: tvilsom reaksjon som definert i nr. 2.2.5.2 bokstav b), negativ: negativ reaksjon bovint tuberkulin som definert i nr. 2.2.5.2 bokstav a).

Dyr som gir usikkert resultat på den enkle intrakutane tuberkulintesten, skal underkastes en ny test tidligst etter 42 dager.

Dyr som ikke reagerer negativt på denne andre testen, skal anses å ha reagert positivt.

Dyr som reagerer positivt på den enkle intradermale testen, kan underkastes en intradermal sammenlignende test dersom det foreligger mistanke om falsk positiv reaksjon eller forstyrrende reaksjon.

positiv: en positiv reaksjon bovint tuberkulin der hevelsen er mer enn 4 mm større enn ved reaksjonen på aviært tuberkulin, eller der det forekommer kliniske tegn, tvilsom: en positiv eller tvilsom reaksjon bovint tuberkulin der hevelsen er 1 – 4 mm større enn ved reaksjonen på aviært tuberkulin, og der det ikke forekommer kliniske tegn, negativ: en negativ reaksjon bovint tuberkulin, eller en positiv eller tvilsom reaksjon bovint tuberkulin der hevelsen er mindre enn eller lik hevelsen ved en positiv eller tvilsom reaksjon på aviært tuberkulin og der det ikke under noen omstendighet forekommer kliniske tegn.

Dyr som gir usikkert resultat på den enkle intradermale tuberkulintesten, skal underkastes en ny test tidligst etter 42 dager. Dyr som ikke reagerer negativt på denne andre testen, skal anses å ha reagert positivt.

dyr som gir usikkert resultat på den enkle intradermale tuberkulintesten, dyr som har reagert positivt på den enkle intradermale tuberkulintesten, men som senere skal underkastes en intrakutan sammenlignende prøve, dyr som gir usikkert resultat på den intradermale sammenlignende testen.

Dersom dyrene ifølge Fellesskapets regelverk skal underkastes en intrakutan test før de flyttes, skal testen tolkes slik at dyr som viser en økning i hudfoldens tykkelse på mer enn 2 mm eller kliniske tegn, ikke inngår i handelen innenfor Fellesskapet.

For å gjøre det mulig å påvise det største antall smittede og syke dyr i en besetning eller i en region, kan medlemsstatene endre kriteriene for tolking av testen for å forbedre følsomheten, og betrakte alle usikre reaksjoner nevnt i nr. 2.2.5.3.1 bokstav b) og 2.2.5.3.2 bokstav b) som positive reaksjoner.

TILLEGGSTESTER

For å gjøre det mulig å påvise det største antall smittede og syke dyr i en besetning eller en region, kan medlemsstatene, i tillegg til tuberkulinprøven, tillate bruk av gamma-interferon-testen nevnt i kapittel 2.3.3 (bovin tuberkulose) i fjerde utgave (2000) av OIEs Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines.

OFFENTLIGE INSTITUTTER OG NASJONALE REFERANSELABORATORIER

De offentlige instituttene og referanselaboratoriene oppført i nr. 4.2 skal ha ansvar for den offisielle utprøvingen av tuberkuliner eller reagenser nevnt i nr. 2 og 3 i sine respektive stater for å sikre at disse tuberkulinene eller reagensene oppfyller standardene nevnt ovenfor.

Tyskland Paul-Ehrlich Institut (PEI), Bundesamt für Sera und Impstoffe, D-23207 Langen; Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin – Bereich Jena – D-07743 Jena Belgia Institut scientifique de la santé publique – Louis Pasteur, rue Juliette Wytsman 14, B-1050 Brussel Frankrike: Laboratoire national des médicaments vétérinaires, Fougères Storhertugdømmet Luxembourg Leverandørstatens institutt Italia Istituto superiore di Sanità, Roma Nederland: Centraal Instituut voor Dierziekte Controle Lelystad (CIDC-Lelystad), Lelystad Danmark Danmarks Veterinærinstitut, Bülowsvej 27, DK-1790 København Irland Leverandørstatens institutt Det forente kongerike Veterinary Laboratory Agency, Addlestone, Weybridge Hellas Kεντρo Kτηνιατρικων Iδρυματων, Nεαπoλεωζ 25, 153 10 Aυνα Spania Laboratorio de Sanidad y producción Animal de Granada Portugal Laboratório Nacional de Investigação Veterinária, Lisboa Østerrike Bundesanstalt für veterinärmedizinische Untersuchungen, Mödling Finland Eläinlääkintä- ja elintarviketutkimuslaitos – Forskningsanstalten för veterinärmedicin och livsmedel, Helsingfors Sverige Statens veterinärmedicinska anstalt, Uppsala.»

II

Endringene trer i kraft straks.