Forskrift om endring i forskrift om dyrehelsemessige betingelser for innførsel og utførsel av storfe

I

I forskrift 25. mars 2002 nr. 305 om dyrehelsemessige betingelser for innførsel og utførsel av storfe gjøres følgende endringer:

I EØS-henvisningsfeltet til EØS-avtalen vedlegg I kap. I direktiv 64/432/EØF tilføyes vedtak 2009/976/EU.

§ 3a første ledd skal lyde:

Krav til testing for bovin tuberkulose, bovin brucellose og bovin leukose følger av forskriftens vedlegg H, jf. vedlegg B, C og D kapittel II til direktiv 64/432/EØF som endret ved direktiv 97/12/EF, forordning (EF) nr. 535/2002, forordning (EF) nr. 1226/2002, vedtak 2006/911/EF, vedtak 2007/729/EF, vedtak 2008/984/EF og vedtak 2009/976/EF.

Vedlegg H skal lyde:

Konsolidert og EØS-tilpasset direktiv 64/432/EØF vedlegg B, C og D kapittel II

Kapittel I – tuberkulose (fra direktiv 64/432/EØF vedlegg B)

Forekomst av Mycobacterium bovis (M. bovis) , agens for storfetuberkulose, i kliniske prøver og post mortem-prøver kan påvises ved undersøkelse av fargede utstrykspreparater eller immunoperoksidaseteknikker og bekreftes ved dyrking av organismen i primære isolasjonsmedier.

Patologisk materiale for bekreftelse av M. bovis bør tas fra unormale lymfeknuter og parenkymatøse organer som lunger, lever, milt osv. I tilfeller der dyret ikke har patologiske forandringer, bør det tas prøver fra retrofaryngeale lymfeknuter, bronkiale lymfeknuter, mediastinale lymfeknuter, supramammære lymfeknuter, kjevelymfeknuter og enkelte av mesenteriets lymfeknuter og leverens lymfeknuter med henblikk på undersøkelse og dyrking.

Identifisering av isolater kan vanligvis foretas ved å bestemme dyrkingsmessige og biokjemiske egenskaper. Polymerasekjedereaksjonen (PCR) kan også brukes til å oppdage M. tuberculosis -komplekset. DNA-analyseteknikker kan vise seg å være hurtigere og mer pålitelige enn biokjemiske metoder til å skille M. bovis fra andre medlemmer av M. tuberculosis -komplekset. Genetiske avtrykk gjør det mulig å skille mellom forskjellige stammer av M. bovis og vil gjøre det mulig å beskrive mønstre for opprinnelse, overføring og spredning av M. bovis .

De teknikker og medier som brukes, standardiseringen av dem og tolkingen av resultatene må være i samsvar med det som er angitt i kapittel 2.3.3 (bovin tuberkulose) i OIEs Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines (fjerde utgave, 2000).

Renset proteinderivat av tuberkulin som oppfyller vilkårene fastsatt i nr. 2.1 skal brukes til å utføre offisiell intradermal tuberkulintest i samsvar med framgangsmåtene nevnt i nr. 2.2.

2.1. Standarder for tuberkulin (bovint og aviært)

Renset proteinderivat (PPD-tuberkulin, bovint eller aviært) er et preparat som framstilles av de varmebehandlede produktene av vekst og lysering av Mycobacterium bovis og Mycobacterium avium (etter hva som er aktuelt), som kan avsløre en forsinket overfølsomhet i et dyr som er sensibilisert overfor mikroorganismer av samme art.

Tuberkulinet lages av de vannløselige fraksjonene som tilberedes ved oppvarming i frittflytende damp og deretter filtrering av kulturer av M. bovis og M. avium (etter hva som er aktuelt) dyrket i et flytende syntetisk medium. Filtratets aktive fraksjon, som består hovedsakelig av protein, isoleres ved utfelling, vaskes og oppløses på nytt. Et antimikrobielt konserveringsmiddel som ikke forårsaker falske positive reaksjoner, som fenol, kan tilsettes. Det sterile sluttpreparatet, fritt for mykobakterier, fordeles aseptisk i sterile glassbeholdere sikret mot inngrep, som så lukkes for å hindre kontaminering. Preparatet kan frysetørkes.

Sprøyt inn flere graderte doser intrakutant på forskjellige steder i passende sensibiliserte albinomarsvin som hvert veier ikke mindre enn 250 g. Etter 24-28 timer framkommer reaksjoner i form av ødematøse hevelser med rødme av huden med eller uten nekrose i innsprøytingspunktene. Hvor store og alvorlige reaksjonene er, varierer med dosen. Usensibiliserte marsvin viser ingen reaksjoner på lignende innsprøytinger.

2.1.4. Tester

pH: pH-verdien er 6,5-7,5.

Fenol: Dersom preparatet som skal undersøkes, inneholder fenol, skal konsentrasjonen ikke være over 5 g/l.

Sensibiliserende virkning: Bruk en gruppe på tre marsvin som ikke er behandlet med noe materiale som vil forstyrre testen. Tre ganger med fem dagers mellomrom sprøytes en dose av preparatet som skal undersøkes, intrakutant inn i hvert marsvin med en dose tilsvarende 500 IE i 0,1 ml. 15-21 dager etter den tredje innsprøytingen sprøytes samme dose (500 IE) intrakutant inn i disse dyrene og i en kontrollgruppe med tre marsvin med samme vekt og som ikke tidligere har fått tuberkulininnsprøyting. 24-28 timer etter siste innsprøyting er reaksjonene hos de to gruppene ikke vesentlig forskjellige.

Giftighet: Bruk to marsvin som hvert veier ikke mindre enn 250 g og som ikke tidligere er behandlet med noe materiale som vil påvirke testen. Sprøyt intrakutant inn i hvert marsvin 0,5 ml av preparatet som skal undersøkes. Observer dyrene i sju dager. Ingen unormale virkninger forekommer i løpet av observasjonsperioden.

Sterilitet: Sterilitetsprøven bør utføres i samsvar med det som er fastsatt i monografien om vaksiner til veterinær bruk, fjerde utgave (2002), av Den europeiske farmakopé.

Styrken av det rensede proteinderivatet (bovint og aviært) bestemmes ved å sammenligne reaksjonene som framkalles i sensibiliserte marsvin av intrakutan innsprøyting av en rekke fortynninger av preparatet som skal undersøkes, med dem som framkalles av kjente konsentrasjoner av et referansepreparat av renset proteinderivat av tuberkulin (bovint eller eventuelt aviært) målt i internasjonale enheter.

For å prøve styrken, sensibiliseres minst ni albinomarsvin, som hvert veier 400 til 600 g, med dyp intramuskulær innsprøyting av 0,0001 mg våt masse av levende M. bovis av stammen AN5 oppslemmet i 0,5 ml av en løsning på 9 g/l med natriumklorid R for bovint tuberkulin, eller en passende dose inaktivt eller levende M. avium for aviært tuberkulin. Ikke mindre enn fire uker etter at marsvinene er sensibilisert, fjernes håret på flankene for å gi plass til minst fire innsprøytingssteder på hver side. Lag fortynninger av preparatet som skal undersøkes og av referansepreparatet ved å bruke en isotonisk fosfatbufret saltløsning (pH mellom 6,5 og 7,5) som inneholder 0,005 g/l polysorbat 80 R. Det brukes minst tre doser av referansepreparatet og minst tre doser av preparatet som skal undersøkes. Dosene velges slik at skadene som oppstår, har en diameter på ikke mindre enn 8 mm og ikke mer enn 25 mm. Fortynningene fordeles vilkårlig på stedene ved å bruke latinsk kvadratmønster. Hver dose sprøytes inn intrakutant i et konstant volum på 0,1 eller 0,2 ml. Etter 24-28 timer måles skadenes diameter, og resultatet av prøven beregnes ved å bruke de vanlige statistiske metodene og forutsette at skadenes diameter er direkte proporsjonal med logaritmen av konsentrasjonen av tuberkulinene.

Prøven er ikke gyldig med mindre pålitelighetsgrensene (P = 0,95) er over 50 % og under 200 % av den beregnede styrken. Den beregnede styrken er over 66 % og under 150 % av den oppgitte styrken for bovint tuberkulin. Den beregnede styrken er over 75 % og under 133 % av den oppgitte styrken for aviært tuberkulin. Den oppgitte styrken er over 20 000 IE/ml for begge tuberkuliner (bovint og aviært).

Beskyttes mot lys, ved en temperatur på 5 ± 3 °C.

styrken i internasjonale enheter per milliliter, navn på og mengde av tilsatte stoffer, for frysetørkede preparater: navn på og volum av den rekonstituerende væsken som skal tilsettes, at produktet bør brukes umiddelbart etter rekonstituering.

2.2. Framgangsmåte ved testing

enkel intradermal test: denne testen krever en enkelt innsprøyting av bovint tuberkulin, intradermal sammenlignende test: denne testen krever en innsprøyting av bovint tuberkulin og en innsprøyting av aviært tuberkulin foretatt samtidig.

ikke mindre enn 2000 IE bovint tuberkulin, ikke mindre enn 2000 IE aviært tuberkulin.

Volumet av hver innsprøyting skal ikke overstige 0,2 ml.

Tuberkulintester skal foretas ved at tuberkulin sprøytes inn i huden på halsen. Innsprøytingsstedene skal ligge i overgangen mellom halsens forreste og midterste tredel. Når både aviært og bovint tuberkulin sprøytes inn i samme dyr, skal innsprøytingsstedet for aviært tuberkulin ligge ca. 10 cm fra halskammen og innsprøytingsstedet for bovint tuberkulin ca. 12,5 cm lavere på en linje som er mer eller mindre parallell med skulderlinjen, eller stedene skal ligge på hver sin side av halsen. På unge dyr der det ikke er plass til å skille stedene tilstrekkelig på én side av halsen, skal en innsprøyting foretas på hver side av halsen på samme sted midt på halsens midterste tredel.

Teknikken for tuberkulintestene og tolking av resultatene er som følger:

Teknikk

Hårene skal fjernes på innsprøytingsstedet, og stedet skal renses. Innenfor hvert av de hårløse områdene skal en hudfold tas mellom pekefinger og tommelfinger og måles med krumpasser, og resultatet skal registreres. Tuberkulindosen skal så sprøytes inn med en metode som sikrer at tuberkulinet gis intrakutant. Det kan brukes en kort, steril kanyle med utvendig skråkant, påsatt en gradert sprøyte fylt med tuberkulin, som føres inn på skrå i hudens dypereliggende lag. Innsprøytingen er foretatt riktig dersom en liten erteaktig hevelse kan føles ved hvert innsprøytingssted. Hudfoldens tykkelse på hvert innsprøytingssted skal måles på nytt 72 timer (± 4 timer) etter innsprøytingen, og resultatet skal registreres.

Tolking av reaksjonene

Negativ reaksjon: dersom hevelsen bare er begrenset og ikke har økt hudfoldens tykkelse med mer enn 2 mm, og det ikke er kliniske tegn som diffust eller utbredt ødem, eksudasjon, nekrose, smerte eller betennelse i lymfekarene i dette området eller i lymfekjertlene. Tvilsom reaksjon: dersom det ikke konstateres kliniske tegn som nevnt i bokstav a), og dersom hudfoldens tykkelse har økt med 2-4 mm. Positiv reaksjon: dersom det konstateres kliniske tegn som nevnt i bokstav a), eller dersom hudfoldens tykkelse på innsprøytingsstedet har økt med mer enn 4 mm.

Offisielle intradermale tuberkulintester tolkes på følgende måte:

positiv: positiv reaksjon på bovint tuberkulin som definert i nr. 2.2.5.2 bokstav c), tvilsom: tvilsom reaksjon som definert i nr. 2.2.5.2 bokstav b), negativ: negativ reaksjon bovint tuberkulin som definert i nr. 2.2.5.2 bokstav a).

Dyr som gir usikkert resultat på den enkle intrakutane tuberkulintesten, skal underkastes en ny test tidligst etter 42 dager.

Dyr som ikke reagerer negativt på denne andre testen, skal anses å ha reagert positivt.

Dyr som reagerer positivt på den enkle intradermale testen, kan underkastes en intradermal sammenlignende test dersom det foreligger mistanke om falsk positiv reaksjon eller forstyrrende reaksjon.

positiv: en positiv reaksjon bovint tuberkulin der hevelsen er mer enn 4 mm større enn ved reaksjonen på aviært tuberkulin, eller der det forekommer kliniske tegn, tvilsom: en positiv eller tvilsom reaksjon bovint tuberkulin der hevelsen er 1-4 mm større enn ved reaksjonen på aviært tuberkulin, og der det ikke forekommer kliniske tegn, negativ: en negativ reaksjon bovint tuberkulin, eller en positiv eller tvilsom reaksjon bovint tuberkulin der hevelsen er mindre enn eller lik hevelsen ved en positiv eller tvilsom reaksjon på aviært tuberkulin og der det ikke under noen omstendighet forekommer kliniske tegn.

Dyr som gir usikkert resultat på den enkle intradermale tuberkulintesten, skal underkastes en ny test tidligst etter 42 dager. Dyr som ikke reagerer negativt på denne andre testen, skal anses å ha reagert positivt.

dyr som gir usikkert resultat på den enkle intradermale tuberkulintesten, dyr som har reagert positivt på den enkle intradermale tuberkulintesten, men som senere skal underkastes en intrakutan sammenlignende prøve, dyr som gir usikkert resultat på den intradermale sammenlignende testen.

Dersom dyrene ifølge Fellesskapets regelverk skal underkastes en intrakutan test før de flyttes, skal testen tolkes slik at dyr som viser en økning i hudfoldens tykkelse på mer enn 2 mm eller kliniske tegn, ikke inngår i handelen innenfor Fellesskapet.

For å gjøre det mulig å påvise det største antall smittede og syke dyr i en besetning eller i en region, kan EØS-statene endre kriteriene for tolking av testen for å forbedre følsomheten, og betrakte alle usikre reaksjoner nevnt i nr. 2.2.5.3.1 bokstav b) og 2.2.5.3.2 bokstav b) som positive reaksjoner.

For å gjøre det mulig å påvise det største antall smittede og syke dyr i en besetning eller en region, kan EØS-statene, i tillegg til tuberkulinprøven, tillate bruk av gamma-interferon-testen nevnt i kapittel 2.3.3 (bovin tuberkulose) i fjerde utgave (2000) av OIEs Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines.

4. Offentlige institutter og nasjonale referanselaboratorier

De offentlige instituttene, nasjonale referanselaboratoriene eller offisielle instituttene som er oppnevnt i overensstemmelse med direktiv 64/432/EØF artikkel 6a, skal være ansvarlige for den offisielle utprøvingen av tuberkuliner eller reagenser henholdsvis nevnt i nr. 2 og 3, i deres respektive medlemsstater for å sikre at disse tuberkuliner eller reagenser oppfyller de standarder nevnt i henholdsvis punkt 2.1 og punkt 3.

Kapittel II – brucellose (fra direktiv 64/432/EØF vedlegg C)

Dersom det påvises organismer med brucellamorfologi i abortmateriale, vaginalutflod eller melk ved hjelp av modifisert syrefast eller immunspesifikk farging, er det overveiende sannsynlighet for brucellose, særlig dersom diagnosen støttes av serologiske tester. Polymerase kjedereaksjon (PCR) er ytterligere et hjelpemiddel for påvisning. Når det er mulig skal Brucella spp isoleres ved å bruke standard eller selektive medier av kultur fra uterus utflod, aborterte foster, spenesekret eller fra utvalgte vev slik som lymfeknuter og kjønnsorganer fra hann- og hundyr.

Etter isolasjon bør mikroorganismer, arter og biovar identifiseres ved hjelp av lysering av bakterievirus og/eller oksydative stoffskifte-undersøkelser, dyrkingskriterier og biokjemiske og serologiske kriterier. PCR kan fremskaffe både en komplementær og en biotyping metode basert på spesifikke gensekvenser.

Metodene og mediene som brukes, standardiseringen av disse og tolkingen av resultatene skal være i samsvar med OIEs Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, sjette utgave, 2008, kapittel 2.4.3 (brucellose hos storfe), kapittel 2.7.2 (brucellose hos geit og sau) og kapittel 2.8.5 (brucellose hos svin).

2. Immunologiske tester

2.1 Standarder

Brucella abortus -biovar 1 Weybridge-stamme nr. 99 eller USDA-stamme 1119-3 skal brukes til framstilling av alle antigener som brukes i Rose Bengal-testen (RBT), serumagglutinasjonstesten (SAT), komplementbindingstesten (CFT) og melkeringtesten (MTR).

Standardreferanseserum for RBT, SAT, CFT og MRT er OIEs internasjonale standardreferanseserum (OIEISS) som tidligere ble kalt WHO annet internasjonale anti- Brucella abortus -serum (ISAbS).

OIEISS, OIEs svakt positive ELISA-standardserum (OIEELISA WP SS), OIEs sterkt positive ELISA-standardserum (OIEELISA SP SS), OIEs negative ELISA-standardserum (OIEELISA N SS).

OIEISS, OIEs svakt positive ELISA-standardserum (OIEELISA WP SS), OIEs sterkt positive ELISA-standardserum (OIEELISA SP SS), OIEs negative ELISA-standardserum (OIEELISA N SS).

Ovennevnte standardsera er tilgjengelige fra Community reference labaratory for brucellosis eller Veterinary Laboratories Agency (VLA), Weybridge, Det forente kongerike.

OIEISS, OIEELISA WP SS, OIEELISA SP SS og OIEELISA N SS er internasjonale primærstandarder som skal brukes til å etablere nasjonale sekundære referansestandarder («arbeidsstandarder») for hver prøve referert til i 2.1.1 i de enkelte EØS-statene.

2.2. Enzymmerket antistofftest (ELISA) eller andre immunbindingstester for påvisning av bovin brucellose i serum eller melk

Metoden som brukes og tolkingen av resultatene skal være godkjent i samsvar med prinsippene fastsatt i kapittel 1.1.4 i OIEs Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, sjette utgave, 2008, og skal minst omfatte laboratorieundersøkelser og diagnostiske undersøkelser.

2.2.2. Standardisering av testen

en fortynning av OIEISS i forholdet 1:150 1 eller en fortynning av OIEELISA WP SS i forholdet 1:2 eller en fortynning av OIEELISA SP SS i forholdet 1:16 i et negativt serum (eller i en negativ serumblanding) skal gi en positiv reaksjon, en fortynning av OIEISS i forholdet 1:600 eller en fortynning av OIEELISA WP SS i forholdet 1:8 eller en fortynning av OIEELISA SP SS i forholdet 1:64 i et negativt serum (eller i en negativ serumblanding) skal gi en negativ reaksjon, OIEELISA N SS skal alltid gi en negativ reaksjon.

en fortynning av OIEISS i forholdet 1:150 eller en fortynning av OIEELISA WP SS i forholdet 1:2 eller en fortynning av OIEELISA SP SS i forholdet 1:16 i et negativt serum (eller i en negativ serumblanding) som igjen er fortynnet i negative sera med antallet prøver som inngår i blandingen, skal gi en positiv reaksjon, OIEELISA N SS skal alltid gi en negativ reaksjon, prøven skal være tilstrekkelig til å påvise infeksjon hos ett enkelt dyr i en gruppe dyr som serumprøvene i blandingen er tatt fra.

en fortynning av OIEISS i forholdet 1:1000 eller en fortynning av OIEELISA WP SS i forholdet 1:16 eller en fortynning av OIEELISA SP SS i forholdet 1:125 i et negativt serum (eller i en negativ serumblanding) som igjen er fortynnet i forholdet 1:10 i negativ melk, skal gi en positiv reaksjon, OIEELISA N SS i forholdet 1:10 i negativ melk skal alltid gi en negativ reaksjon, prøven skal være tilstrekkelig til å påvise infeksjon hos ett enkelt dyr i en gruppe dyr som melke- eller myseprøvene i blandingen er tatt fra.

2.2.3. Vilkår for bruk av ELISA-test for diagnostisering av bovin brucellose

Ved bruk av kalibreringsvilkår for ELISA-tester, som fastsatt i punktene 2.2.2.1 og 2.2.2.2, på serumprøver, skal ELISA-testen diagnostisk være minst like følsom som RBT eller CFT, idet det tas hensyn til den epidemiologiske situasjonen som testen brukes i.

Ved bruk av kalibreringsvilkår for ELISA-tester, som fastsatt i punkt 2.2.2.3, på blandede melkeprøver, skal ELISA-testen diagnostisk være minst like følsom som MRT, idet det ikke bare tas hensyn til den epidemiologiske situasjonen, men også til de gjennomsnittlige og forventede ekstremer av husdyrholdsystemer.

Dersom ELISA-testen brukes med henblikk på utstedelse av et sertifikat i samsvar med artikkel 6 nr. 1, eller med henblikk på etablering og bevaring av en besetningsstatus i samsvar med vedlegg A del II nr. 10, skal serumprøvene blandes på en slik måte at prøvingsresultatene med sikkerhet kan spores tilbake til det enkelte dyr i blandingen. Eventuelle bekreftende prøver skal foretas på serumprøver fra enkeltdyr.

ELISA-tester kan brukes på en melkeprøve tatt fra melk som er samlet inn fra en driftsenhet der minst 30 % av kuene er i laktasjon. Dersom denne metoden brukes, skal det treffes tiltak for å sikre at prøvene som tas ut for undersøkelse, med sikkerhet kan spores tilbake til enkeltdyrene som melken stammer fra. Eventuelle bekreftende prøver skal foretas på serumprøver fra enkeltdyr.

2.3. Komplementbindingstest (CFT)

Antigenet består av en bakteriell suspensjon i fenol-saltløsning (NaCl 0,85 % (m/v) tilsatt 0,5 % (v/v) fenol) eller i en veronal bufferløsning. Antigenene kan leveres i konsentrert form, forutsatt at fortynningsfaktoren som skal brukes, er oppført på flaskens etikett. Antigenet skal oppbevares ved 4 °C og ikke fryses.

serum fra storfe: 56-60 °C i 30-50 minutter, serum fra svin: 60 °C i 30-50 minutter.

For å oppnå en riktig reaksjon på testmetoden, bør det brukes en komplementærdose som er større enn det minimum som er nødvendig til fullstendig hemolyse.

kontroll av serumets antikomplementære virkning, kontroll av antigenet, kontroll av de sensibiliserte røde blodlegemene, kontroll av komplementet, kontroll av følsomheten ved hjelp av et positivt serum når reaksjonen begynner, kontroll av reaksjonens spesifisitet ved hjelp av et negativt serum.

F = 1 000 × 1/T OIEISS og innholdet av internasjonale CFT-enheter per ml prøveserum (CFT PRØVESERUM ) finnes ved formelen: ICFTU PRØVESERUM = F × T PRØVESERUM

Et serum som inneholder 20 ICFTU per ml eller mer, anses som positivt.

2.4. Melkeringtest (MRT)

Antigenet består av en bakteriell suspensjon i fenol-saltløsning (NaCl 0,85 % (m/v) tilsatt 0,5 % (v/v) fenol) farget med hematoxylin. Antigenet skal oppbevares ved 4 °C og ikke fryses.

Antigenets følsomhet skal standardiseres i forhold til OIEISS på en slik måte at antigenet gir en positiv reaksjon med en fortynning av OIEISS i forholdet 1:500 i negativ melk og en negativ reaksjon med en fortynning i forholdet 1:1 000.

Ringtesten skal foretas på prøver som er representative for innholdet av hvert melkespann eller innholdet i hver samletank fra driftsenheten.

Melkeprøvene må ikke ha vært frosset, oppvarmet eller ristet kraftig.

på en melkesøyle som er minst 25 mm høy, og med en melkemengde på 1 ml, som er tilsatt 0,03 ml eller 0,05 ml av et av de standardiserte, fargede antigenene, på en melkesøyle som er minst 25 mm høy, og med en melkemengde på 2 ml, som er tilsatt 0,05 ml av et av de standardiserte, fargede antigenene, på en melkemengde på 8 ml, som er tilsatt 0,08 ml av et av de standardiserte, fargede antigenene.

Blandingen av melk og antigener skal inkuberes ved 37 °C i 60 minutter sammen med positive og negative arbeidsstandarder. Inkubasjon i ytterligere 16-24 timer ved 4 °C øker testens følsomhet.

negativ reaksjon: melken er farget, fløten er avfarget, positiv reaksjon: melken og fløten er farget på samme måte, eller melken er avfarget og fløten er farget.

Rose Bengal-test (RBT) (bufret Brucella antigen test)

Antigenet består av en bakteriell suspensjon i en bufret brucella-antigenløsning med en pH på 3,65 ± 0,05 farget med Rose Bengal-farge. Antigenet skal leveres klart til bruk og skal oppbevares ved 4 °C og ikke fryses.

Antigenet skal framstilles uten hensyn til cellekonsentrasjonen, men følsomheten skal standardiseres i forhold til OIEISS på en slik måte at antigenet gir en positiv reaksjon med en serumfortynning i forholdet 1:45 og en negativ reaksjon med en fortynning i forholdet 1:55.

serum (20-30 μl) blandes med en tilsvarende mengde antigen på en hvit eller emaljert plate slik at det dannes en flate med en diameter på omtrent to cm. Blandingen vippes lett i fire minutter ved romtemperatur og avleses deretter ved god belysning for agglutinasjon, en automatisert metode kan brukes, men den må ha minst samme følsomhet og være minst like nøyaktig som den manuelle metoden.

Enhver synlig reaksjon anses som positiv, med mindre det er ekstraordinær tørking i kantene.

Positive og negative arbeidsstandarder bør tas med i hver testserie.

2.6. Serumagglutinasjonstest (SAT)

Antigenet består av en bakteriell suspensjon i fenol-saltløsning (NaCl 0,85 % (m/v) tilsatt 0,5 % (v/v) fenol). Formaldehyd må ikke brukes.

Antigenene kan leveres i konsentrert form, forutsatt at fortynningsfaktoren som skal brukes, er oppført på flaskens etikett.

Antigensuspensjon kan tilsettes EDTA til en endelig brukskonsentrasjon på 5 mM for å redusere antallet falskt positive testresultater. Antigensuspensjonens pH justeres deretter på nytt til 7,2.

OIEISS inneholder 1 000 internasjonale agglutinasjonsenheter.

Antigenet skal framstilles uten hensyn til cellekonsentrasjonen, men følsomheten skal standardiseres i forhold til OIEISS på en slik måte at antigenet enten gir 50 % agglutinasjon med en endelig serumfortynning på mellom 1:600 og 1:1 000 eller 75 % agglutinasjon med en endelig serumfortynning på mellom 1:500 og 1:750.

Det kan også være tilrådelig å sammenligne reaktiviteten til nye og tidligere antigenserier ved hjelp av et panel av definerte sera.

Testen foretas enten i reagensglass eller på mikroplater. Blandingen av antigen og serumfortynninger skal inkuberes i 16-24 timer ved 37 °C.

Minst tre fortynninger skal tilberedes for hvert serum. Fortynninger av serum under mistanke skal lages på en slik måte at reaksjonen ved positivitetsgrensen avleses i det midterste reagensglasset (eller den midterste fordypningen på mikroplater).

Innholdet av brucella-agglutinasjon i et serum skal uttrykkes i IE per ml.

Et serum som inneholder 30 IE per ml eller mer, anses som positivt.

FPA-testen kan foretas i reagensglass eller 96-brønns plateformat. Teknikken som anvendes, standardisering og tolkning av resultater må samsvare med det som er spesifisert i OIEs Manual 6.e utgave 2008 for standarder mhp diagnostiske tester og vaksiner for landdyr.

OIEELISA SP SS og OIEELISA WP SS konsekvent gir positivet resultat. en fortynning av OIEELISA WP SS i forholdet 1:8 eller en fortynning av OIEELISA SP SS i forholdet 1:64 i et negativt serum (eller i en negativ serumblanding) skal alltid gi en negativ reaksjon; OIEELISA N SS skal alltid gi en negativ reaksjon.

Følgende skal inkluderes i hvert testoppsett: en sterk positiv kontroll, en svak positiv kontroll, en negativ serumkontroll (kalibrert mot OIE ELISA Standard serum).

3. Tilleggsprøver

3.1. Brucellose-intradermaltest (BST)

Brucellose-intradermaltesten skal ikke brukes med henblikk på utstedelse av et sertifikat for handel innenfor Fellesskapet. Brucellose-intradermaltesten er en av de mest spesifikke testene for påvisning av brucellose hos uvaksinerte dyr, men diagnosen bør ikke stilles bare på grunnlag av positive intradermale reaksjoner. Storfe som har reagert negativt på en av de serologiske testene definert i dette vedlegg, og som reagerer positivt på BST, anses som infisert eller mistenkt for å være infisert. Storfe, som har reagert positivt på en av de serologiske testene definert i dette vedlegg, kan gjennomgå en BST-test som støtte for tolkingen av resultatene av de serologiske testene, særlig dersom en kryssreaksjon med antistoffer mot andre bakterier ikke kan utelukkes i brucellosefrie eller offisielt brucellosefrie storfebesetninger.

Testen skal foretas ved hjelp av et standardisert og definert brucellose-allergenpreparat som ikke inneholder glatt lipopolysakkarid-antigen (LPS), ettersom det kan framkalle uspesifikke betennelsesreaksjoner eller forstyrre senere serologiske tester.

Framstillingskravene for Brucellin skal være i samsvar med del C1 i kapittel 2.4.3 i OIEs Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, sjette utgave, 2008.

3.1.3. Testingsmetode

0,1 ml brucellose-allergen injiseres intradermalt i halefolden, flanken eller siden av halsen.

Prøven avleses etter 48-72 timer.

Hudtykkelsen på injeksjonsstedet måles med skyvelær før injeksjonen og ved den påfølgende undersøkelsen.

Tolking av resultatene:

Sterke reaksjoner gjenkjennes lett ved lokal hevelse og indurasjon.

En hudtykkelse på 1,5 til 2 mm anses som en positiv reaksjon på BST.

3.2. Kompetitiv ELISA-test (cELISA)

cELISA-testen skal ikke brukes med henblikk på utstedelse av et sertifikat for handel innenfor Fellesskapet.

Storfe, som er testet med positivt resultat med en av de andre serologiske testene som er definert i dette vedlegget, kan undersøkes med cELISA-testen som støtte for tolkingen av resultatene av de andre serologiske testene; særlig i de brucellosefrie eller offisielt brucellosefrie storfebesetningene hvor det ikke kan utelukkes en kryss-reaksjon med antistoffer mot andre bakterier.

Testen skal foretas i samsvar med bestemmelsene i del B (2) i kapittel 2.4.3 i OIEs Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, sjette utgave, 2008.

4. Statlige institusjoner og nasjonale referanselaboratorier

godkjenning av resultatene av valideringsundersøkelsene som dokumenterer at testmetoden som brukes i EØS-staten, er pålitelig, fastsettelse av høyeste antall prøver som kan inngå i en samleprøve i ELISA-testsettene som brukes i EØS-staten, kalibrering av bruksstandarder som nevnt i nr. 2.1.6; kvalitetskontroll av alle antigener og partier av ELISA-testsett som brukes i EØS-staten, å følge anbefalinger fra, og å samarbeide med EU's referanselaboratorium (CRL) for brucellose.

Kapittel III – Leukose (fra direktiv 64/432/EØF vedlegg D, kapittel II)

Prøver for å påvise enzootisk bovin leukose

Enzootisk bovin leukose påvises ved hjelp av en immundiffusjonsprøve (AGID-agar gel immuno-diffusion test) som beskrevet i avsnitt A og B nedenfor, eller ved en enzymmerket antistoffprøve (ELISA-enzyme-linked immunosorbent assay) som beskrevet i avsnitt C nedenfor. Immundiffusjonsmetoden er forbeholdt prøver på enkeltdyr. Dersom det gjøres velbegrunnet innsigelse mot prøveresultatene, skal det utføres en tilleggskontroll ved hjelp av en immundiffusjonsprøve.

Friedrich-Loeffler-Institut Federal Research Institute for Animal Health OIE Reference Laboratory for Enzootic Bovine Leukosis (EBL) Südufer 10 17493 Greifswald–Insel Riems Tyskland.

Det antigenet som brukes i prøven, skal inneholde glykoproteiner fra bovint leukosevirus. Antigenet skal standardiseres etter E05-serum De offentlige instituttene, nasjonale referanselaboratoriene eller offisielle instituttene, som er oppnevnt i overensstemmelse med direktiv 64/432/EØF artikkel 6a for å være ansvarlige for å koordinere standarder og diagnostiseringsmetoder for påvisning av enzootisk bovin leukose, skal være ansvarlige for at standardantigenet til laboratoriebruk kalibreres i forhold til E05-serumet. Standardantigener til laboratoriebruk skal minst en gang årlig sendes til de offentlige instituttene, nasjonale referanselaboratoriene eller offisielle instituttene, som er oppnevnt i overensstemmelse med direktiv 64/432/EØF artikkel 6a, for å prøves mot det offisielle EØF-standardserumet. I tillegg til denne standardisering kan det antigenet som brukes kalibreres i samsvar med del B. Prøvens reagenser skal bestå av: antigen: antigenet skal inneholde særskilte glykoproteiner fra enzootisk bovint leukosevirus som er blitt standardisert etter det offisielle EØF-serumet, det serum som skal prøves, et kjent positivt kontrollserum, agarose: 0,8 % agar 8,5 % NaCl 0,05 M Tris-buffer, pH 7,2, 15 ml av agaren skal helles i en petriskål med diameter 85 mm slik at agardybden blir på 2,6 mm. I agaren skal det skjæres ut sju fuktfrie hull helt til skålens bunn; hullene skal danne et mønster med et hull i midten og seks hull i en sirkel rundt det. Midthullets diameter: 4 mm De ytre hullenes diameter: 6 mm Avstanden mellom det midtre og de ytre hull: 3 mm. Midthullet fylles med standardantigen. Ytre hull nr. 1 og 4 (se diagrammet nedenfor) fylles med det kjente positive serumet og hull nr. 2, 3, 5 og 6 med de sera som skal prøves. Hullene skal fylles inntil menisken forsvinner. De mengdene som oppnås, er følgende: antigen: 32 mikroliter kontrollserum: 73 mikroliter serum som skal prøves: 73 mikroliter. Inkubasjonstiden skal være 72 timer i romtemperatur (20-27 °C) i et fuktig, lukket kammer. Prøven kan avleses etter 24 og 48 timer, men det kan ikke oppnås noe endelig resultat før etter 72 timer: det serumet som skal prøves, er positivt dersom det danner en særskilt utfellingslinje med BLV-antigenet og danner en helt identisk linje med kontrollserumet, det serumet som skal prøves, er negativt dersom det ikke danner en særskilt utfellingslinje med BLV-antigenet og dersom det ikke bøyer av kontrollserumets linje, reaksjonen kan ikke anses som sikker dersom den: bøyer av kontrollserumets linje mot hullet med BLV-antigen uten å danne en synlig utfellingslinje med antigenet, eller verken kan tolkes som negativ eller positiv. Dersom reaksjonen er tvilsom, kan prøven gjentas med konsentrert serum. Hullene kan danne et annet mønster dersom E05-serum fortynnet i forholdet 1:10 i negativt serum kan påvises som positivt.

B. Metode for standardisering av antigen

40 ml 1,6 % agarose i 0,05 M Tris/HCl buffer, pH 7,2 med 8,5 % NaCl, 15 ml bovint leukoseserum som inneholder antistoffer bare mot glykoproteiner fra bovint leukosevirus; fortynning: 1:10 i 0,05 M Tris/HCl buffer, pH 7,2 med 8,5 % NaCl, 15 ml bovint leukoseserum som inneholder antistoffer bare mot glykoproteiner fra bovint leukosevirus; fortynning: 1:5 i 0,05 M Tris/HCl buffer, pH 7,2 med 8,5 % NaCl, fire petriskåler av plast med en diameter på 85 mm, en gelbor med en diameter på 4-6 mm, et referanseantigen, det antigen som skal standardiseres, et vannbad ( 56 °C).

Framgangsmåte

Agarosen (1,6 %) oppløses i Tris/HCl buffer ved forsiktig oppvarming til 100 °C. Den settes i et vannbad på 56 °C i ca 1 time. Fortynningene med bovint leukoseserum settes også i vannbad på 56 °C.

Deretter blandes 15 ml av agaroseløsningen som holder 56 °C, med 15 ml bovint leukoseserum (1:10); dette ristes raskt og helles i to petriskåler, 15 ml i hver. Framgangsmåten gjentas med det bovine leukoseserumet med en fortynning på 1:5.

Når agarosen er blitt hard, lages det huller for tilsetting av antigen, som beskrevet nedenfor.

Petriskål 1 og 3: hull A – ufortynnet referanseantigen, hull B – referanseantigen, fortynning 1:2, hull C og E – referanseantigen, hull D – ufortynnet antigen som skal prøves. Petriskål 2 og 4: hull A – ufortynnet antigen som skal prøves, hull B – antigen som skal prøves, fortynning 1:2, hull C – antigen som skal prøves, fortynning 1:4, hull D – antigen som skal prøves, fortynning 1:8.

Forsøket skal utføres med to serumfortynninger (1:5 og 1:10) for å oppnå størst mulig utfelling. Dersom utfellingsdiameteren er for liten for begge fortynningene, må serumet fortynnes enda mer. Dersom utfellingsdiameteren er for stor for begge fortynningene, og dersom den forsvinner, må det velges et serum som er mindre fortynnet. Agarosens sluttkonsentrasjon skal være 0,8 %, og seraenes sluttkonsentrasjon henholdsvis 5 % og 10 %.

Følgende materialer og reagenser skal benyttes: mikroplater, skåler eller andre former for fast fase, antigenet bindes til den faste fasen med eller uten bruk av polyklonale eller monoklonale oppfangende antistoffer. Dersom antigenet påføres direkte på den faste fasen, må alle prøver som skal undersøkes og som har gitt positive reaksjoner, undersøkes på nytt mot kontrollantigenet når det gjelder enzootisk bovin leukose. Kontrollantigenet bør være identisk med det antigenet som undersøkes, med unntak av BLV-antigenene. Dersom oppfangende antistoffer påføres den faste fasen, skal antistoffene ikke reagere med andre antigener enn BLV-antigenene, den biologiske væsken som skal undersøkes, en tilsvarende positiv og negativ kontroll, konjugat, et substrat som er tilpasset det enzymet som blir brukt, en stoppeløsning om nødvendig, løsninger til fortynning av de prøvene som skal undersøkes, til framstilling av reagenser og til vask, et avlesingssystem som egner seg til det substratet som blir brukt. Standardisering av prøven og prøvens følsomhet ELISA-prøven skal være så følsom at E05-serumet reagerer positivt når det fortynnes ti ganger (serumprøver) eller 250 ganger (melkeprøver) mer enn den fortynningen som fås ved samleprøver. Når prøver (serum og melk) undersøkes separat, skal E05-serumet, som fortynnes i forholdet 1:10 (i negativt serum) eller 1:250 (i negativ melk), reagere positivt når det undersøkes i den samme fortynning som brukes for prøver på enkeltdyr. De offentlige instituttene oppført i avsnitt A nr. 2 har ansvar for kvalitetskontrollen med ELISA-metoden og skal særlig for hvert parti fastsette hvor mange prøver som skal inngå i en samleprøve på grunnlag av titeret som oppnås med E05-serum. Vilkår for å benytte ELISA-prøven for å påvise enzootisk bovin leukose ELISA-metoden kan brukes på serum og melkeprøver. Dersom ELISA-metoden brukes for å utstede et sertifikat i samsvar med denne forskriftens § 7 annet ledd, punkt 3, eller for å etablere og bevare en besetningsstatus i samsvar med direktiv 64/432/EØF vedlegg D kapittel I, skal serum- eller melkeprøvene blandes på en slik måte at prøvene som skal undersøkes, med sikkerhet kan spores tilbake til det enkelte dyret i samleprøven. Eventuelle bekreftende prøver skal foretas på prøver fra enkeltdyr. Når ELISA-test er benyttet på en tankmelkprøve, skal prøven være hentet fra en driftsenhet der minst 30 % av kuene er i laktasjon. En prøve tatt for å bekrefte testen skal utføres på serum eller melkeprøve fra det enkelte dyr.

II

Endringene trer i kraft straks.