Forskrift om endring i kontrollforskriften

I

I forskrift 22. desember 2008 nr. 1621 om offentlig kontroll med etterlevelse av regelverk om fôrvarer, næringsmidler og helse og velferd hos dyr (kontrollforskriften) gjøres følgende endringer:

I EØS-henvisningsfeltet skal henvisningen til forordning (EF) nr. 152/2009 lyde:

nr. 31o (forordning (EF) nr. 152/2009 som endret ved forordning (EU) nr. 278/2012 forordning (EU) nr. 51/2013, forordning (EU) nr. 691/2013 og forordning (EU) nr. 709/2014).

§ 2 skal lyde:

EØS-avtalens vedlegg I kapittel II nr. 31o (forordning (EF) nr. 152/2009 som endret ved forordning (EU) nr. 278/2012, forordning (EU) nr. 51/2013, forordning (EU) nr. 691/2013) og forordning (EU) nr. 709/2014 om metoder for prøvetakings- og analysemetoder ved offentlig kontroll av fôr gjelder som forskrift med de tilpasninger som følger av vedlegg I, protokoll 1 til avtalen og avtalen for øvrig.

II

Endringene trer i kraft straks.

Forordninger

Endringer som gjøres under avsnittet «Forordninger» under konsolidert forordning (EF) nr. 152/2009 i kontrollforskriften er:

Innledningsteksten til konsolidert forordning (EF) nr. 152/2009 skal lyde:

Nedenfor gjengis til informasjon norsk oversettelse av forordning (EF) nr. 152/2009. Dette er grunnrettsakten. Grunnrettsakten er endret ved forordning (EU) nr. 278/2012, forordning (EU) nr. 51/2013, forordning (EU) nr. 691/2013) og forordning (EU) nr. 709/2014 med de endringer og tillegg som følger av EØS-tilpasningen av rettsakten i samsvar med vedlegg I og protokoll 1 til EØS-avtalen.

Forordning (EF) nr. 152/2009 er konsolidert til og med endringer gjennomført ved forordning (EU) nr. 278/2012, forordning (EU) nr. 51/2013, forordning (EU) nr. 691/2013 og forordning (EU) nr. 709/2014.

I konsolideringsoversikten tilføyes følgende:

► M4 Forordning (EU) nr. 709/2014 av 20. juni 2014.

Artikkel 1 til forordning (EF) nr. 152/2009 skal lyde:

► M3

Artikkel 1

Prøvetaking som ledd i den offentlige kontrollen av fôr, særlig med hensyn til bestemmelse av bestanddeler, herunder materiale som inneholder eller består av eller er framstilt av genmodifiserte organismer (GMO), tilsetningsstoffer i fôrvarer som definert i europaparlaments- og rådsforordning (EF) nr. 1831/2003, * uønskede stoffer som definert i europaparlaments- og rådsdirektiv 2002/32/EF, ** skal foretas i samsvar med metodene som er angitt i vedlegg I.

Prøvetakingsmetoden som er angitt i vedlegg I, får anvendelse på kontroll av fôr med hensyn til bestemmelse av rester av plantevernmidler som definert i europaparlaments- og rådsforordning (EF) nr. 396/2005 *** og kontroll av forenlighet med forordning (EU) nr. 619/2011.◄ M3

* ► M3 EUT L 268 av 18.10.2003, s. 29.

** EFT L 140 av 30.5.2002, s. 10.

*** EUT L 70 av 16.3.2005, s. 1. ◄ M3

Vedlegg I og vedlegg II til forordning (EF) nr. 152/2009 skal lyde:

► M3

VEDLEGG I Prøvetakingsmetoder

1. Formål og virkeområde

Prøver bestemt til offentlig kontroll av fôr, skal tas i samsvar med metodene som beskrives nedenfor. Prøver som tas på denne måten, skal anses som representative for de delene det tas prøver av.

Formålet med representativ prøvetaking er å ta ut en brøkdel av et parti på en slik måte at bestemmelsen av særlige kjennetegn ved denne brøkdelen representerer gjennomsnittet av partiets kjennetegn. Det skal tas ut prøver av partiet gjennom gjentatte uttak av enkeltprøver fra forskjellige steder i partiet. Disse enkeltprøvene skal blandes slik at de utgjør en samleprøve som det tillages representative sluttprøver fra gjennom representativ deling.

Dersom det ved en visuell kontroll viser seg at en del av fôret som det skal tas prøver av, er av en annen kvalitet enn resten av fôret i samme parti, skal slike deler skilles fra resten av fôret og behandles som et særskilt delparti. Dersom det ikke er mulig å dele opp fôret i særskilte delpartier, skal det tas prøver som fra ett parti. I slike tilfeller skal dette nevnes i prøvetakingsrapporten.

Dersom det fastslås at fôr som det tas prøver av i samsvar med bestemmelsene i denne forordning, og som ikke oppfyller EUs krav, utgjør en del av et parti fôr av samme klasse eller betegnelse, skal det antas at alt fôr i dette partiet er berørt, med mindre det som følge av en nærmere vurdering ikke kan dokumenteres at den resterende delen av partiet ikke oppfyller EUs krav.

2. Definisjoner

Parti: En identifisert mengde fôr, der det er fastslått felles kjennetegn som opprinnelse, type, emballasjetype, emballeringsbedrift, avsender eller merking; og når det gjelder en produksjonsprosess: en produksjonsenhet fra ett anlegg, der det anvendes ensartede produksjonsparametrer, eller flere slike enheter, dersom de er framstilt fortløpende og lagres sammen. Prøvemengde: Et parti eller en identifisert del av et parti eller delparti. Forseglet prøve: En prøve som er forseglet på en måte som hindrer enhver tilgang til prøven uten å bryte eller fjerne forseglingen. Enkeltprøve: En mengde tatt fra ett punkt i prøvemengden. Samleprøve: En blanding av enkeltprøver som tas fra samme prøvemengde. Redusert prøve: En del av samleprøven som tas ut av denne gjennom representativ reduksjon. Sluttprøve: En del av den reduserte prøven eller av den homogeniserte samleprøven. Laboratorieprøve: En prøve bestemt til laboratorieundersøkelse (som mottatt av laboratoriet), som kan være en sluttprøve, en redusert prøve eller en samleprøve.

3. Alminnelige bestemmelser

Prøvetakingspersonale: Prøvene skal tas av personer som er godkjent for formålet av vedkommende myndighet. Prøven skal forsegles på en måte som hindrer enhver tilgang til prøven uten å bryte eller fjerne forseglingen. Forseglingens merke bør være klart identifiserbart og synlig. Alternativt kan prøven plasseres i en beholder som kan lukkes på en slik måte at den ikke kan åpnes uten at det medfører uopprettelig skade på beholderen, slik at man unngår gjenbruk av beholderen. Identifisering av prøven: Prøven skal være merket på en uutslettelig måte og må identifisere på en slik måte at det er en utvetydig forbindelse til prøvetakingsrapporten. Fra hver enkelt samleprøve tas det minst to sluttprøver: minst én til kontroll (håndhevingsformål) og en til den driftsansvarlige for fôrforetaket (klageadgangsformål). Til slutt kan det tas én sluttprøve for referanseformål. Dersom hele samleprøven homogeniseres, skal sluttprøvene tas fra den homogeniserte samleprøven, med mindre en slik framgangsmåte er i strid med medlemsstatenes bestemmelser om rettighetene til den driftsansvarlige for fôrforetaket.

4. Utstyr

Prøvetakingsutstyret må være laget av materialer som ikke kan kontaminere produktene det skal tas prøver av. Utstyr som skal anvendes flere ganger, må være lett å rengjøre for å unngå krysskontaminering.

4.2. Anbefalt utstyr for prøvetaking av fôr i fast form

4.2.1. Manuell prøvetaking

4.2.1.1. Spade med flat bunn og loddrette sider

Prøvetakingssonde med lang spalte eller kamre. Prøvetakingssondens dimensjoner må være tilpasset forholdene prøvemengden befinner seg i (f.eks. beholderens dybde, sekkens dimensjoner osv.) og størrelsen på partiklene i fôret.

Dersom prøvetakingssonden har flere åpninger for å sikre at prøvene tas på forskjellige steder langs sonden, skal åpningene være atskilt av kamre eller sekvensielt forskjøvede åpninger.

Egnet mekanisk utstyr kan brukes til prøvetaking fra fôr i bevegelse. Med egnet menes at det tas prøver av minst hele tverrsnittet av flyten.

Prøvetaking av fôr i bevegelse (med høy flythastighet) kan utføres med automatisk prøvetakingsutstyr.

Dersom det er mulig og hensiktsmessig, bør utstyr som er utformet for å dele prøven i tilnærmet like store deler, anvendes for å tillage prøver på en representativ måte.

5. Kvantitative krav til antall enkeltprøver

De kvantitative kravene i nr. 5.1 og 5.2 til antall enkeltprøver gjelder for prøvemengder med en vekt på opp til 500 tonn som kan tas på en representativ måte. Den angitte framgangsmåten for prøvetaking gjelder også for mengder som er større enn den angitte største størrelsen på partier som det tas prøver av, forutsatt at det ses bort fra det høyeste antall enkeltprøver som er angitt i tabellene nedenfor, at antall enkeltprøver fastsettes ved hjelp av den kvadratrotsformelen som er fastsatt i den relevante delen av framgangsmåten (se nr. 5.3), og at samleprøvens minstestørrelse økes proporsjonalt med dette. Dette er ikke til hinder for at et stort parti kan deles opp i mindre delpartier, og at det tas prøver av hvert delparti i samsvar med framgangsmåten som beskrives i nr. 5.1 og 5.2. Partiets størrelse må være slik at det kan tas prøver av hver av partiets bestanddeler. For svært store partier eller delpartier (> 500 tonn) og partier som transporteres eller lagres på en slik måte at det ikke kan tas prøver i samsvar med framgangsmåten som beskrives i nr. 5.1 og 5.2 i dette kapittel, anvendes framgangsmåten fastsatt i nr. 5.3. Dersom den driftsansvarlige for fôrforetaket i henhold til regelverket har plikt til å overholde denne forordning som ledd i et obligatorisk overvåkingssystem, kan den driftsansvarlige for fôrforetaket avvike fra de kvantitative kravene som er fastsatt i dette kapittel for å ta hensyn til operative særtrekk, forutsatt at den driftsansvarlige for fôrforetaket har på tilfredsstillende måte har godtgjort overfor vedkommende myndighet at prøvetakingsmetoden er likeverdig med hensyn til representativitet og etter godkjenning fra vedkommende myndighet. Dersom det ikke er mulig å anvende den fastsatte prøvetakingsmetoden med hensyn til de kvantitative kravene uten at det får uakseptable økonomiske konsekvenser som følge av skade på partiet (på grunn av emballasjeformen, transportmiddelet, lagringsmåten osv.), kan det benyttes en annen prøvetakingsmetode, forutsatt at den er så representativ som mulig og at den beskrives og dokumenteres fullt ut.

5.1. Kvantitative krav til enkeltprøver i forbindelse med kontroll av stoffer eller produkter som er jevnt fordelt i fôret

Uemballert fôr i fast form Prøvemengdens størrelse Minste antall enkeltprøver ≤ 2,5 tonn 7 > 2,5 tonn √ 20 ganger det antall tonn partiet består av, * opp til 40 enkeltprøver

* Når det oppnådde tallet er en brøk, skal den avrundes oppover til nærmeste hele tall.

Uemballert fôr i flytende form Prøvemengdens størrelse Minste antall enkeltprøver ≤ 2,5 tonn eller ≤ 2500 liter 4 * > 2,5 tonn eller > 2500 liter 7 *

* Dersom det ikke er mulig å homogenisere væsken, skal antall enkeltprøver økes.

Fôr (i fast og flytende form) kan emballeres i sekker, poser, esker, tønner osv., som i tabellen er omhandlet som enheter. Fra store enheter (≥ 500 kg eller liter) tas prøver i samsvar med bestemmelsene om uemballert fôr (se nr. 5.1.1 og 5.1.2).

Prøvemengdens størrelse Minste antall enheter som det skal tas (minst) én enkeltprøve fra * Inntil 20 enheter 1 enhet ** 21–150 enheter 3 enheter ** 151–400 enheter 5 enheter ** > 400 enheter ¼ av det √antall enheter som utgjør prøvemengden, *** opp til 40 enheter

* Dersom åpningen av en enhet kan påvirke analysen (f.eks. lett bedervelig vått fôr), skal den uåpnede enheten utgjøre en enkeltprøve.

** For enheter med et innhold som ikke overstiger 1 kg eller 1 liter, skal én opprinnelig enhet utgjøre en enkeltprøve.

*** For enheter med et innhold som ikke overstiger 1 kg eller 1 liter, skal én opprinnelig enhet utgjøre en enkeltprøve.

Det skal tas prøver av minst 1 brikett eller saltslikkestein per parti på 25 enheter, men høyst 4 briketter eller saltslikkesteiner.

For briketter eller saltslikkesteiner som ikke veier mer enn 1 kg hver, skal én enkeltprøve utgjøres av innholdet i én brikett eller én saltslikkestein.

Grovfôr/fôrvekster Prøvemengdens størrelse Minste antall enkeltprøver * ≤ 5 tonn 5 > 5 tonn √ 5 ganger det antall tonn partiet består av, ** opp til 40 enkeltprøver

* Det erkjennes at det i enkelte situasjoner (f.eks. ved ensilasje) ikke er mulig å ta de påkrevde enkeltprøvene uten å skade partiet på uakseptabel måte. En alternativ prøvetakingsmetode kan anvendes i slike situasjoner, og før denne forordnings ikrafttredelse vil det bli utarbeidet en veiledning om prøvetaking av slike partier.

** Når det oppnådde tallet er en brøk, skal den avrundes oppover til nærmeste hele tall.

kontroll av aflatoksiner, meldrøye, andre mykotoksiner og skadelige botaniske urenheter i fôrmidler, kontroll av krysskontaminering fra en bestanddel, herunder genmodifisert materiale eller stoff som vanligvis er ujevnt fordelt i fôrmidler.

Dersom kontrollmyndigheten har sterk mistanke om at der forekommer en ujevn fordeling også i tilfelle av krysskontaminering fra en bestanddel eller et stoff i en fôrblanding, kan de kvantitative kravene i tabellen nedenfor anvendes. Prøvemengdens størrelse Minste antall enkeltprøver < 80 tonn Se de kvantitative kravene i nr. 5.1. Antall enkeltprøver som skal tas, skal multipliseres med 2,5. ≥ 80 tonn 100

Når det gjelder store prøvemengder (prøvemengder > 500 tonn), er antall enkeltprøver som skal tas = 40 enkeltprøver + √tonn ved kontroll av stoffer eller produkter som er jevnt fordelt i fôret, eller 100 enkeltprøver + √tonn ved kontroll av bestanddeler eller stoffer som kan være ujevnt fordelt i fôrmidler.

6. Kvantitative krav til samleprøver

Det kreves én enkelt samleprøve fra hvert parti det tas prøve av. Fôrets art Samleprøvens minstestørrelse * , ** 6.1. Uemballert fôr 4 kg 6.2. Emballert fôr: 4 kg *** 6.3. Flytende eller halvflytende fôr: 4 liter 6.4. Fôrbriketter eller saltslikkesteiner: 6.4.1 Med en vekt på over 1 kg per stk. 4 kg 6.4.2. Med en vekt på inntil 1 kg per stk. Vekten av 4 opprinnelige briketter eller saltslikkesteiner 6.5. Grovfôr/fôrvekster 4 kg ****

* Dersom fôret det tas prøver av er av høy verdi, kan det tas en mindre mengde samleprøve forutsatt at dette beskrives og dokumenteres i prøvetakingsrapporten.

** I henhold til bestemmelsene i kommisjonsforordning (EU) nr. 619/2011 av 24. juni 2011 om metoder for prøvetaking og analyser for den offentlige fôrkontrollen med hensyn til forekomst av genmodifisert materiale i påvente av godkjenning eller når godkjenningen er utløpt (EUT L 166 av 25.6.2011, s. 9) skal samleprøven til kontroll av forekomst av genmodifisert materiale inneholde minst 35 000 frø/korn. Dette innebærer at størrelsen på samleprøven skal være minst 10,5 kg for mais og 7 kg for soyaolje. For andre frø og korn, f.eks. bygg, hirse, havre, ris, rug, hvete og rapsfrø, tilsvarer størrelsen på samleprøven på 4 kg flere enn 35 000 frø/korn.

*** Når det gjelder emballert fôr, er det heller ikke alltid mulig å oppnå en størrelse på 4 kg for samleprøven, avhengig av de enkelte enhetenes størrelse.

**** Når det gjelder grovfôr eller fôrplanter med lav egenvekt (f.eks. høy, halm), skal samleprøven være på minst 1 kg.

7. Kvantitative krav til sluttprøver

Sluttprøver

Det kreves analyse av minst én sluttprøve. Mengden av sluttprøven som skal analyseres, skal ikke være mindre enn: Fôr i fast form 500 g * , ** , *** Flytende eller halvflytende fôr 500 ml *

* I henhold til bestemmelsene i forordning (EU) nr. 619/2011 skal sluttprøver til kontroll av forekomst av genmodifisert materiale inneholde minst 10 000 frø/korn. Dette innebærer at størrelsen på sluttprøven skal være minst 3000 g for mais og 2000 g for soyaolje. For andre frø og korn, f.eks. bygg, hirse, havre, ris, rug, hvete og rapsfrø, tilsvarer størrelsen på sluttprøven på 500 g flere enn 10 000 frø/korn.

** Dersom størrelsen på samleprøven er betydelig mindre enn 4 kg eller liter (se fotnotene under nr. 6), kan det også tas en mindre mengde sluttprøve, forutsatt at dette beskrives og dokumenteres i prøvetakingsrapporten.

*** Når det gjelder prøvetaking av belgfrukter, korn og nøtter til bestemmelse av innholdet av rester av plantevernmidler, skal sluttprøvens minstestørrelse være 1 kg i samsvar med bestemmelsene i kommisjonsdirektiv 2002/63/EF (EFT L 187 av 16.7.2002, s. 30).

8. Prøvetakingsmetode for svært store partier eller partier som lagres og transporteres på en måte som gjør det umulig å ta prøver i hele partiet

Dersom transport eller lagring av et parti gjør det umulig å ta enkeltprøver i hele partiet, bør det tas prøver av slike partier når partiet er i flyt.

Når det gjelder store lagre som er beregnet på lagring av fôr, bør driftsansvarlige oppfordres til å installere utstyr i lagrene, som gjør det mulig å foreta (automatisk) prøvetaking i hele det lagrede partiet.

Ved anvendelse prøvetakingsmetodene som er omhandlet i dette kapittel 8, underrettes den driftsansvarlige for fôrforetaket eller dennes representant om den prøvetakingsmetoden. Dersom den driftsansvarlige for fôrforetaket eller dennes representant er i tvil når det gjelder denne framgangsmåten for prøvetaking, skal den driftsansvarlige for fôrforetaket eller dennes representant gi vedkommende myndighet mulighet til å ta prøver av hele partiet for hans/hennes regning.

8.2. Store partier som transporteres med skip

Prøvetaking av store partier i skip skal fortrinnsvis foretas mens produktet er i flyt (dynamisk prøvetaking).

Prøvetakingen skal foretas per lasterom (enhet som kan atskilles fysisk). Lasterommene tømmes imidlertid ikke hver for seg, så den opprinnelige fysiske atskillelsen eksisterer ikke lenger etter overføringen til lagringsstedene. Prøvetaking kan derfor foretas enten på grunnlag av den opprinnelige fysiske atskillelsen eller atskillelsen etter overføringen til lagringsstedene.

Det kan ta flere dager å losse et skip. Vanligvis skal prøvetaking foretaks med jevne mellomrom så lenge lossingen pågår. Det er imidlertid ikke alltid mulig eller hensiktsmessig at en offisiell inspektør er til stede for å ta prøver under hele lossingen. Det er derfor tillatt å gjennomføre prøvetaking av en del (prøvemengde) av hele partiet. Antall enkeltprøver fastsettes ut fra prøvemengdens størrelse.

Ved prøvetaking av en del av et parti fôr av samme klasse eller betegnelse skal det, når det fastslås at denne delen av partiet ikke oppfyller EUs krav, antas at alt fôr i partiet er berørt, med mindre det etter en nærmere vurdering ikke foreligger dokumentasjon for at den resterende delen av partiet ikke oppfyller EUs krav.

Selv om den offisielle prøven tas automatisk, skal en inspektør være til stede. Dersom den automatiske prøvetakingen foretas med forhåndsinnstilte parametrer som ikke kan endres under prøvetakingen, og enkeltprøvene samles i en forseglet beholder som hindrer eventuelt svindel, kreves det at inspektøren er til stede bare når prøvetakingen starter, hver gang prøvebeholderen skal skiftes ut og når prøvetakingen avsluttes.

Dersom prøvetakingen foretas på en statisk måte, må det anvendes samme framgangsmåte som den som gjelder for lagringssteder (siloer) som er tilgjengelige ovenfra (se nr. 8.4.1).

Prøvene skal tas (ovenfra) fra den tilgjengelige delen av partiet/lasterommet. Antall enkeltprøver fastsettes ut fra prøvemengdens størrelse. Ved prøvetaking av en del av et parti fôr av samme klasse eller betegnelse skal det, når det fastslås at denne delen av partiet ikke oppfyller EUs krav, antas at alt fôr i partiet er berørt, med mindre det etter en nærmere vurdering ikke foreligger dokumentasjon for at den resterende delen av partiet ikke oppfyller EUs krav.

Prøvene skal tas fra den tilgjengelige delen av partiet. Antall enkeltprøver fastsettes ut fra prøvemengdens størrelse. Ved prøvetaking av en del av et parti fôr av samme klasse eller betegnelse skal det, når det fastslås at denne delen av partiet ikke oppfyller EUs krav, antas at alt fôr i partiet er berørt, med mindre det etter en nærmere vurdering ikke foreligger dokumentasjon for at den resterende delen av partiet ikke oppfyller EUs krav.

8.4. Prøvetaking fra lagre (siloer)

Prøvene skal tas fra den tilgjengelige delen av partiet. Antall enkeltprøver fastsettes ut fra prøvemengdens størrelse. Ved prøvetaking av en del av et parti fôr av samme klasse eller betegnelse skal det, når det fastslås at denne delen av partiet ikke oppfyller EUs krav, antas at alt fôr i partiet er berørt, med mindre det etter en nærmere vurdering ikke foreligger dokumentasjon for at den resterende delen av partiet ikke oppfyller EUs krav.

8.4.2. Prøvetaking fra siloer som ikke er tilgjengelige ovenfra (lukkede siloer)

Det kan ikke tas prøver på en statisk måte av fôr som lagres i slike siloer. Dersom det skal tas prøver av fôr i en slik silo og det ikke er mulig å flytte partiet, skal det derfor inngås avtale med den driftsansvarlige om at han/hun skal underrette inspektøren om når siloen vil bli tømt, slik at det kan tas prøver mens fôret er i flyt.

Prøvetakingsmetoden innebærer overføring til en beholder med en størrelse på 50–100 kg, som prøven tas fra. Samleprøvens størrelse skal tilsvare hele partiet, og antall enkeltprøver skal beregnes ut fra mengden i den siloen som fôr overføres til en beholder fra med sikte på prøvetaking. Ved prøvetaking av en del av et parti fôr av samme klasse eller betegnelse skal det, når det fastslås at denne delen av partiet ikke oppfyller EUs krav, antas at alt fôr i partiet er berørt, med mindre det etter en nærmere vurdering ikke foreligger dokumentasjon for at den resterende delen av partiet ikke oppfyller EUs krav.

Prøver fra slike partier kan ofte ikke tas før de losses. Det er i enkelte tilfeller mulig å losse beholderne ved innførsel eller kontroll, og prøvetakingen bør derfor foretas når beholderne losses.

9. Veiledning for uttak, tillaging og emballering av prøvene

Prøvene må tas og tillages uten unødig opphold under overholdelse av de forholdsregler som er nødvendige for å unngå at produktet endres eller kontamineres. Instrumenter, overflater og beholdere som prøvene skal plasseres i, må være rene og tørre.

Enkeltprøver må tas vilkårlig fra hele partiet, og de må være av tilnærmet samme størrelse.

Enkeltprøvens størrelse skal være på minst 100 g eller 25 g når det gjelder grovfôr eller fôrplanter med lav egenvekt.

Dersom det i henhold til den prøvetakingsmetoden som er fastsatt i avsnitt 8, skal tas færre enn 40 enkeltprøver, skal enkeltprøvenes størrelse fastsettes ut fra størrelsen som kreves for samleprøver (se nr. 6).

Dersom det skal tas prøver av mindre partier av emballert fôr, og det i henhold til de kvantitative kravene skal tas et begrenset antall enkeltprøver, skal en enkeltprøve utgjøres av innholdet i én opprinnelig enhet med et innhold som ikke overstiger 1 kg eller 1 liter.

Ved prøvetaking av emballert fôr som består av små enheter (f.eks. < 250 g), avhenger antall enkeltprøver av enhetens størrelse.

Prøvetaking kan om nødvendig foretas mens partiet er i bevegelse (under lasting eller lossing).

Etter at det fastsatte antall enheter er valgt ut til prøvetaking som angitt i kapittel 5, skal en del av innholdet i hver enhet tas ut med sonde eller skuffe. Prøvetakingen kan om nødvendig foretas etter at enhetene er tømt hver for seg.

Etter at det fastsatte antall enheter er valgt ut til prøvetaking som angitt i kapittel 5, homogeniseres innholdet om nødvendig, og det tas ut en mengde fra hver enhet.

Enkeltprøvene kan eventuelt tas mens innholdet tømmes ut.

Etter at det fastsatte antall enheter er valgt ut til prøvetaking som angitt i kapittel 5, skal det tas prøver fra forskjellige nivåer.

Prøver kan også tas mens innholdet i beholderne tømmes ut, men de første fraksjonene skal kasseres.

I begge tilfeller må samlet uttatt volum ikke være mindre enn 10 liter.

Etter at det fastsatte antall briketter eller saltslikkesteiner er valgt ut til prøvetaking som angitt i kapittel 5, kan det tas ut en prøve fra en del av hver brikett eller saltslikkestein. Dersom det er mistanke om at briketten eller saltslikkesteinen ikke er homogen, kan hele briketten eller saltslikkesteinen tas ut som prøve.

For briketter eller saltslikkesteiner som ikke veier mer enn 1 kg hver, skal én enkeltprøve utgjøres av innholdet i én brikett eller én saltslikkestein.

Enkeltprøvene skal blandes slik at de utgjør én enkelt samleprøve.

Hver prøve skal plasseres i en egnet beholder. Alle nødvendige tiltak må treffes for å unngå at prøvens sammensetning endres eller at den kontamineres eller forfalskes under transport eller lagring. Ved kontroll av bestanddeler eller stoffer som er jevnt fordelt i fôret, kan samleprøven reduseres på en representativ måte til minst 2,0 kg eller 2,0 liter (redusert prøve), 2 fortrinnsvis ved anvendelse av et mekanisk eller automatisk deleapparat. Ved kontroll av forekomst av rester av plantevernmidler i belgfrukter, korn og trenøtter skal minstestørrelsen på den reduserte prøven være 3 kg. Dersom fôrtypen gjør det umulig å anvende et deleapparat, eller dersom et deleapparat ikke er tilgjengelig, kan prøven reduseres med firedelingsmetoden. Fra de reduserte prøvene tillages sluttprøvene (til kontroll-, klageadgangs- og referanseformål) av tilnærmet samme størrelse og i samsvar med de kvantitative kravene i kapittel 7. Ved kontroll av bestanddeler, herunder genmodifisert materiale eller stoffer som kan være ujevnt fordelt i fôrmidler, skal samleprøven være fullstendig homogenisert og deretter delt opp i sluttprøver, eller redusert til minst 2 kg eller 2 liter 3 ved anvendelse av et mekanisk eller automatisk deleapparat. Bare i tilfeller der fôrtypen gjør det umulig å anvende et deleapparat, kan prøven om nødvendig reduseres med firedelingsmetoden. Med sikte på kontroll av forekomst av genmodifisert materiale i henhold til forordning (EU) nr. 619/2011 må den reduserte prøven inneholde minst 35 000 frø/korn for å oppnå sluttprøvene som kreves til håndhevings-, klageadgangs- og referanseformål på minst 10 000 frø/korn (se fotnote ** i kapittel 6 og fotnote * i kapittel 7).

Beholderne eller pakningene skal forsegles og forsynes med etiketter på en slik måte at de ikke kan åpnes uten at forseglingen brytes. Hele etiketten må inngå i forseglingen.

Prøven skal uten unødig opphold sendes til det utpekte analyselaboratoriet sammen med de opplysningene som er nødvendige for analysen.

1 Eventuelle klumper skal knuses (om nødvendig ved at de tas ut og legges tilbake i prøven).

2 Unntatt når det gjelder grovfôr eller fôrplanter med lav egenvekt.

3 Unntatt når det gjelder grovfôr eller fôrplanter med lag egenvekt.

Registrering av prøver

For hver prøve må det utarbeides en rapport slik at hvert parti og dets størrelse kan identifiseres på en utvetydig måte.

Ethvert avvik fra prøvetakingsmetoden som er fastsatt i denne forordning, skal også registreres.

De registrerte opplysningene skal gjøres tilgjengelig for det offisielle kontrollaboratoriet samt for den driftsansvarlige for fôrforetaket og/eller det laboratoriet som er utpekt av fôrforetaket. ◄ M3 ► M3

Vedlegg II Alminnelige bestemmelser om analysemetoder for fôr

A. Tillaging av analyseprøver

Framgangsmåtene som beskrives nedenfor, gjelder tillaging med sikte på analyse av prøver som er sendt til kontrollaboratoriene etter prøvetaking i samsvar med bestemmelsene i vedlegg I.

Laboratorieprøvene skal tillages på en slik måte at mengdene, som er veid opp slik analysemetodene beskriver, er homogene og representative for sluttprøvene.

Framgangsmåten for tillaging av prøven avhenger av hvilke analysemetoder som skal anvendes og hvilke bestanddeler eller stoffer som skal kontrolleres. Det er derfor svært viktig å sikre at framgangsmåten for tillaging av prøver som følges, er hensiktsmessig for den analysemetoden som anvendes og for de bestanddelene eller stoffene som skal kontrolleres.

Alle nødvendige arbeidstrinn skal utføres slik at kontaminering av prøven og endring av dens sammensetning i størst mulig grad unngås.

Findeling, blanding og sikting skal utføres uten opphold slik at prøven i minst mulig omfang utsettes for luft og lys. Det bør ikke brukes kverner eller andre findelingsapparater som kan varme opp prøven i merkbar grad.

Manuell findeling anbefales for fôr som er særlig følsomt for varme. Det bør også utvises forsiktighet for å sikre at selve utstyret ikke er en kilde til kontaminering.

Dersom tillagingen ikke kan utføres uten at det fører til vesentlige endringer i vanninnholdet i prøven, må vanninnholdet bestemmes før og etter tillagingen, i samsvar med metoden fastsatt i vedlegg III del A.

Delmengden av prøven tas fra sluttprøven. Koning og firedeling anbefales ikke ettersom dette kan resultere i delmengder av prøven med høy feilmargin.

Den siktede sluttprøven blandes og samles opp i en egnet beholder som er tørr, ren og utstyrt med lufttett lukkeanordning. Sluttprøven blandes igjen for å sikre fullstendig homogenisering umiddelbart før mengden som skal analyseres, veies (delmengden av prøven).

Med mindre annet er angitt i analysemetodene, skal sluttprøven tørkes for å få vanninnholdet ned til et nivå på 8–12 %, i samsvar med framgangsmåten for forhåndstørking som beskrevet under 4.3 om metoden for bestemmelse av vanninnhold omhandlet i vedlegg III del A. Deretter følges anvisningene i 3.1.1.

Sluttprøven samles opp i en egnet beholder som er tørr, ren og utstyrt med lufttett lukkeanordning. Sluttprøven blandes grundig for å sikre fullstendig homogenisering umiddelbart før mengden som skal analyseres, veies (delmengden av prøven).

Sluttprøver som ikke kan tillages etter noen av framgangsmåtene beskrevet ovenfor, skal tillages etter en annen framgangsmåte som sikrer at mengdene som veies opp for analyse (delmengdene av prøven), er homogene og representative for sluttprøvene.

Ved undersøkelse gjennom visuell kontroll (uten bruk av mikroskop) anvendes hele laboratorieprøven til undersøkelsen. Ved mikroskopisk undersøkelse kan laboratoriet redusere samleprøven eller redusere den reduserte prøven ytterligere. Sluttprøver til klagebehandlings- og eventuelt referanseformål tas ut etter en framgangsmåte som tilsvarer framgangsmåten som følges for sluttprøver til håndhevingsformål. Dersom hele samleprøven er homogenisert, tas sluttprøvene fra den homogeniserte samleprøven.

Prøvene må oppbevares ved en temperatur som ikke fører til endringer i sammensetningen av prøvene. Prøver som skal brukes til analyse av vitaminer eller stoffer som er særlig følsomme for lys, skal oppbevares under forhold som gjør at prøven ikke påvirkes negativt av lys.

B. Bestemmelser om reagenser og utstyr som brukes i forbindelse med analysemetodene

Med mindre annet er angitt i analysemetodene, må alle reagenser være av analysekvalitet (p.a.). Ved analyse av sporstoffer må reagensenes renhet kontrolleres med en blindprøve. Resultatet av blindprøven avgjør om reagensen må renses ytterligere.

Ved enhver tillaging av løsninger, fortynning, skylling eller vasking som nevnes i analysemetodene uten angivelse av løsnings- eller fortynningsmiddelets art, skal det brukes vann. Vannet skal vanligvis være demineralisert eller destillert. I særlige tilfeller, som er angitt i analysemetodene, må vannet gjennomgå særlige renseprosesser.

I betraktning av utstyret som normalt finnes i kontrollaboratorier, omhandler analysemetodene bare de instrumentene eller apparatene som er beregnet på særlige formål, eller som skal oppfylle særskilte krav. Utstyret må være godt rengjort, særlig når det er svært små mengder av stoffer som skal bestemmes.

C. Gjennomføring av analysemetodene og angivelse av resultatene

Flere metoder fastsetter en særskilt framgangsmåte for ekstraksjon. Som hovedregel kan andre framgangsmåter for ekstraksjon enn de som det vises til i metoden, anvendes, forutsatt at det er dokumentert at de framgangsmåtene som anvendes, har tilsvarende ekstraksjonseffektivitet for den analyserte matrisen, som den som omtales i metoden.

Flere metoder fastsetter en særskilt framgangsmåte for rensing. Som hovedregel kan andre framgangsmåter for rensing enn de det vises til i metoden, anvendes, forutsatt at det er dokumentert at de framgangsmåtene som anvendes, gir tilsvarende analyseresultater for den analyserte matrisen som den som omtales i metoden.

Når det gjelder analyse av uønskede stoffer, der resultatene av første bestemmelse er signifikant (dvs. >50 %) lavere enn den spesifikasjonen som skal kontrolleres, er ingen ytterligere bestemmelse nødvendig, forutsatt at hensiktsmessige kvalitetsprosedyrer er anvendt. I andre tilfeller er to analyser (en annen bestemmelse) nødvendig for å utelukke muligheten for intern krysskontaminering eller utilsiktet forveksling av prøver. Gjennomsnittet av de to bestemmelsene skal bekrefte at kravene er oppfylt, idet det tas hensyn til måleusikkerheten.

Når det gjelder kontroll av det angitte innholdet av et stoff eller ingrediens, der resultatet av den første bestemmelsen bekrefter det angitte innholdet, dvs. at analyseresultatet er innenfor det akseptable variasjonsområdet for det angitte innholdet, er det ikke nødvendig med ytterligere bestemmelse, forutsatt at hensiktsmessige kvalitetsprosedyrer er anvendt. I andre tilfeller er to analyser (en annen bestemmelse) nødvendig for å utelukke muligheten for intern krysskontaminering eller utilsiktet forveksling av prøver. Gjennomsnittet av de to bestemmelsene skal bekrefte at kravene er oppfylt, idet det tas hensyn til måleusikkerheten.

I noen tilfeller defineres det akseptable variasjonsområdet i regelverk, f.eks. i europaparlaments- og rådsforordning (EF) nr. 767/2009 av 13. juli 2009 om markedsføring og bruk av fôrvarer, endring av europaparlaments- og rådsforordning (EF) nr. 1831/2003 og oppheving av rådsdirektiv 79/373/EØF, kommisjonsdirektiv 80/511/EØF, rådsdirektiv 82/471/EØF, 83/228/EØF, 93/74/EØF, 93/113/EF og 96/25/EF samt kommisjonsvedtak 2004/217/EF. 1

1 EUT L 229 av 1.9.2009, s. 1.

Den anvendte analysemetoden skal nevnes i analyserapporten.

Analyseresultatene skal uttrykkes på den måten som er fastsatt i analysemetoden, med et hensiktsmessig antall signifikante tall, og skal om nødvendig være korrigert for vanninnholdet i sluttprøven før tillaging.

Når det gjelder uønskede stoffer i henhold til direktiv 2002/32/EF, skal et produkt beregnet på fôrvarer anses for ikke å være i samsvar med den fastsatte øvre grenseverdien for restmengder dersom analyseresultatet for fôr med et vanninnhold på 12 %, anses å overskride den fastsatte øvre grenseverdien, idet det tas hensyn til den utvidede måleusikkerheten og korreksjonen for gjenfinning. Den analyserte konsentrasjonen korrigert for gjenfinning og utvidet måleusikkerhet brukes til å vurdere samsvar. Denne framgangsmåten kan anvendes bare i de tilfeller der analysemetoden gjør det mulig å anslå måleusikkerheten og korreksjonen for gjenfinning (dette er f.eks. ikke mulig ved mikroskopisk analyse).

korrigert for gjenfinning, med angivelse av gjenfinningsprosent. Korreksjon for gjenfinningsprosent er ikke nødvendig når gjenfinningsprosenten ligger på mellom 90 % og –110 %. som «x +/– U», der x er analyseresultatet og U den utvidede måleusikkerheten, ved bruk av en dekningsfaktor på 2 som gir et konfidensintervall på ca. 95 %.

Dersom analyseresultatet er signifikant lavere (> 50 %) enn den spesifikasjonen som skal kontrolleres, og forutsatt at hensiktsmessige kvalitetsprosedyrer er anvendt og analysen bare har som formål å kontrollere samsvar med bestemmelser i regelverket, kan analyseresultatet likevel rapporteres uten korreksjon for gjenfinning, og rapportering av gjenfinningsprosent og måleusikkerhet kan i disse tilfellene utelates.◄ M3

Del B i vedlegg V til forordning (EF) nr. 152/2009 skal lyde:

► M4

B. Bestemmelse av innholdet av dioksiner (PCDD/PCDF) og PCB

Prøver beregnet på offentlig kontroll av innholdet av polyklorerte dibenzo-p-dioksiner (PCDD), polyklorerte dibenzofuraner (PCDF), dioksinlignende polyklorerte bifenyler (PCB) 1 og ikke-dioksinlignende PCB i fôrvarer skal tas i samsvar med bestemmelsene i vedlegg I. De kvantitative kravene i forbindelse med kontroll av stoffer eller produkter som er jevnt fordelt i fôrvarene, som fastsatt i nr. 5.1 i vedlegg I, skal anvendes. Samleprøver som oppnås på denne måten, skal anses som representative for de partier eller delpartier de er tatt fra. På grunnlag av innholdet som blir funnet i laboratorieprøvene, skal det fastslås om grenseverdiene fastsatt i direktiv 2002/32/EF er overholdt.

I denne del B får definisjonene fastsatt i vedlegg I til kommisjonsdirektiv 2002/657/EF 2 anvendelse.

I tillegg til disse definisjonene menes i denne del B med:

«Screeningmetoder» metoder for utvelging av de prøver der innholdet av PCDD/PCDF og dioksinlignende PCB overskrider grenseverdiene eller tiltaksgrensene. De skal sikre en kostnadseffektiv og høy produktivitet med hensyn til antall prøver som analyseres, som øker muligheten til å oppdage nye tilfeller som innebærer høy eksponering og helsefare for forbrukerne. Screeningmetodene skal være basert på bioanalytiske metoder eller GC-MS-metoder. Prøveresultater som overskrider terskelverdien, som er oppnådd i forbindelse med kontroll av om grenseverdien overholdes, skal kontrolleres ved å analysere den opprinnelige prøven på nytt med en bekreftelsesmetode.

WHOs toksisitetsekvivalensfaktorer (TEF) til vurdering av risikoen for mennesker på grunnlag av konklusjonene fra Verdens helseorganisasjons ekspertmøte i Genève i juni 2005 om et internasjonalt program for kjemikaliesikkerhet (IPCS) (Martin van den Berg et al., The 2005 World Health Organization Re-evaluation of Human and Mammalian Toxic Equivalency Factors for Dioxins and Dioxin-like Compounds. Toxicological Sciences 93(2), 223-241 (2006)). Forbindelse TEF-verdi Forbindelse TEF-verdi Dibenzo-p-dioksiner (PCDD) og dibenzo-p-furaner (PCDF) Dioksinlignende PCB: Non-orto PCB + mono-orto PCB 2,3,7,8-TCDD 1 1,2,3,7,8-PeCDD 1 Non-orto PCB 1,2,3,4,7,8-HxCDD 0,1 PCB 77 0,0001 1,2,3,6,7,8-HxCDD 0,1 PCB 81 0,0003 1,2,3,7,8,9-HxCDD 0,1 PCB 126 0,1 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 0,01 PCB 169 0,03 OCDD 0,0003 Mono-orto PCB 2,3,7,8-TCDF 0,1 PCB 105 0,00003 1,2,3,7,8-PeCDF 0,03 PCB 114 0,00003 2,3,4,7,8-PeCDF 0,3 PCB 118 0,00003 1,2,3,4,7,8-HxCDF 0,1 PCB 123 0,00003 1,2,3,6,7,8-HxCDF 0,1 PCB 156 0,00003 1,2,3,7,8,9-HxCDF 0,1 PCB 157 0,00003 2,3,4,6,7,8-HxCDF 0,1 PCB 167 0,00003 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF 0,01 PCB 189 0,00003 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 0,01 OCDF 0,0003

Forkortelser som er brukt: T = tetra, Pe = penta, Hx = heksa, Hp = hepta, O = okta, CDD = klordibenzodioksin, CDF = klordibenzofuran, CB = klorbifenyl.

2 Kommisjonsvedtak 2002/657/EF av 14. august 2002 om gjennomføring av rådsdirektiv 96/23/EF med hensyn til analysemetoders ytelse og tolking av resultater (EFT L 221 av 17.8.2002, s. 8.)

Partiet er i samsvar med grenseverdien dersom analyseresultatet ikke overskrider grenseverdien for ikke-dioksinlignende PCB fastsatt i direktiv 2002/32/EF, idet det tas hensyn til måleusikkerheten.

Partiet er ikke i samsvar med grenseverdien dersom den øvre konsentrasjonen 1 som analyseresultatet viser, bekreftet ved en ny analyse, 2 overskrider grenseverdien fastsatt i direktiv 2002/32/EF, idet det tas hensyn til måleusikkerheten. Gjennomsnittet av de to bestemmelsene, idet det tas hensyn til måleusikkerheten, brukes for å bekrefte at kravene er oppfylt.

Ved å beregne utvidet usikkerhet ved hjelp av en dekningsfaktor på 2, som gir et konfidensnivå på ca. 95 %. Et parti eller delparti oppfyller ikke kravene dersom den målte verdien minus U overskrider grenseverdien. Ved å fastsette beslutningsgrensen (CCα) i samsvar med nr. 3.1.2.5 i vedlegg I til vedtak 2002/657/EF. Et parti eller delparti oppfyller ikke kravene dersom den målte verdien er lik eller høyere enn CCα.

Nr. 1, 2 og 3 får anvendelse på resultatene av den analyserte prøven beregnet på offentlig kontroll. Ved analyse for klageadgangs- eller referanseformål gjelder nasjonale regler.

utført ved hjelp av en screeningmetode der andelen falskt negative prøver er under 5 %, angir at innholdet ikke overskrider grenseverdien for henholdsvis PCDD/PCDF og summen av PCDD/PCDF og dioksinlignende PCB fastsatt i direktiv 2002/32/EF, utført ved hjelp av en bekreftelsesmetode ikke overskrider grenseverdien for henholdsvis PCDD/PCDF og summen av PCDD/PCDF og dioksinlignende PCB som fastsatt i direktiv 2002/32/EF, idet det tas hensyn til måleusikkerheten.

For screeningprøver skal det fastsettes en terskelverdi som danner grunnlaget for beslutningen om hvorvidt prøven overholder de ulike grenseverdiene som er fastsatt for enten PCDD/PCDF eller for summen av PCDD/PCDF og dioksinlignende PCB.

Partiet er ikke i samsvar med grenseverdien dersom den øvre konsentrasjonen 3 som analyseresultatet viser, oppnådd ved en bekreftelsesmetode og bekreftet ved en analyse nummer to, overskrider grenseverdien fastsatt i direktiv 2002/32/EF, idet det tas hensyn til måleusikkerheten. 4 Gjennomsnittet av de to bestemmelsene, idet det tas hensyn til måleusikkerheten, brukes for å bekrefte at kravene er oppfylt.

Ved å beregne utvidet usikkerhet ved hjelp av en dekningsfaktor på 2, som gir et konfidensnivå på ca. 95 %. Et parti eller delparti oppfyller ikke kravene dersom den målte verdien minus U overskrider grenseverdien. Dersom PCDD/PCDF og dioksinlignende PCB bestemmes hver for seg, brukes summen av den beregnede utvidede usikkerheten for de separate analyseresultatene for PCDD/PCDF og dioksinlignende PCB på summen av PCDD/PCDF og dioksinlignende PCB. Ved å fastsette beslutningsgrensen (CCα) i samsvar med nr. 3.1.2.5 i vedlegg I til vedtak 2002/657/EF. Et parti eller delparti oppfyller ikke kravene dersom den målte verdien er lik eller høyere enn CCα.

Nr. 1–4 får anvendelse på resultatene av den analyserte prøven beregnet på offentlig kontroll. Ved analyse for klageadgangs- eller referanseformål gjelder nasjonale regler.

1 Begrepet «øvre konsentrasjon» innebærer at bidraget fra hver forbindelse som ikke er mengdebestemt, settes lik grensen for mengdebestemmelse. Begrepet «nedre konsentrasjon» innebærer at bidraget fra hver forbindelse som ikke er mengdebestemt, settes lik null. Begrepet «mellomkonsentrasjon» innebærer at bidraget fra hver forbindelse som ikke er mengdebestemt, settes lik halvparten av grensen for mengdebestemmelse.

2 Generelt sett skal kravet til dobbeltanalysering som fastsatt i kapittel C nr. 3 i vedlegg II få anvendelse. For bekreftelsesmetoder der det brukes en 13C-merket intern standard for de relevante analyttene, er dobbeltanalyseringen bare nødvendig dersom resultatene av den første bestemmelsen der det brukes slike bekreftelsesmetoder, ikke oppfyller kravene. Prøvene må analyseres to ganger for å utelukke muligheten for intern krysskontaminering eller utilsiktet forveksling av prøver. Dersom analysen utføres i forbindelse med en forurensning, kan bekreftelse ved dobbeltanalysering sløyfes dersom prøvene som er tatt ut til analysering, kan knyttes til forurensningen ved hjelp av sporbarhet, og det konstaterte innholdet er betydelig over grenseverdien.

3 Begrepet «øvre konsentrasjon» innebærer at bidraget til toksisitetsekvivalenten (TEQ) som ikke er mengdebestemt, settes lik verdien for grensen for mengdebestemmelse. Begrepet «nedre konsentrasjon» innebærer at bidraget til TEQ fra hver forbindelse som ikke er mengdebestemt, settes lik null. Begrepet «mellomkonsentrasjon» innebærer at bidraget til TEQ fra hver forbindelse som ikke er mengdebestemt, settes lik halvparten av verdien for grensen for mengdebestemmelse.

4 Generelt sett skal kravet til dobbeltanalysering som fastsatt i kapittel C nr. 3 i vedlegg II få anvendelse. For bekreftelsesmetoder der det brukes en 13C-merket intern standard for de relevante analyttene, er dobbeltanalyseringen bare nødvendig dersom resultatene av den første bestemmelsen der det brukes slike bekreftelsesmetoder, ikke oppfyller kravene. Prøvene må analyseres to ganger for å utelukke muligheten for intern krysskontaminering eller utilsiktet forveksling av prøver. Dersom analysen utføres i forbindelse med en forurensning, kan bekreftelse ved dobbeltanalysering sløyfes dersom prøvene som er tatt ut til analysering, kan knyttes til forurensningen ved hjelp av sporbarhet, og det konstaterte innholdet er betydelig over grenseverdien.

Tiltaksgrenser er et verktøy som gjør det mulig å velge ut prøver i tilfeller der det er nødvendig å identifisere en forurensningskilde, og å treffe tiltak for å redusere eller fjerne den. Hensiktsmessige terskelverdier for utvelging av disse prøvene skal fastsettes ved hjelp av screeningmetoder. Dersom betydelig arbeid er nødvendig for å identifisere en kilde og redusere eller fjerne forurensningen, kan det være hensiktsmessig å bekrefte overskridelsen av tiltaksgrensen ved å utføre en dobbeltanalyse ved bruk av en bekreftelsesmetode og idet det tas hensyn til måleusikkerheten. 1

1 Samme forklaring og krav til dobbeltanalysering for kontroll av tiltaksgrenser som for grenseverdier i kapittel I pkt. 2.1. fotnote 1.

Kravene fastsatt i dette kapittel får anvendelse når fôrvarer analyseres med henblikk på offentlig kontroll av innholdet av 2,3,7,8-substituerte polyklorerte dibenzo-p-dioksiner (PCDD), polyklorerte dibenzofuraner (PCDF) og dioksinlignende polyklorerte bifenyler (dioksinlignende PCB) og andre forskriftsmessige formål.

Screeningmetoder

Målet med screeningmetoder er å velge ut de prøver der innholdet av PCDD/PCDF og dioksinlignende PCB overskrider grenseverdiene eller tiltaksgrensene. Screeningmetodene bør sikre en kostnadseffektiv og høy produktivitet med hensyn til antall prøver som analyseres, som øker muligheten til å oppdage nye tilfeller som innebærer høy eksponering og helsefare for forbrukerne. Bruken av disse metodene bør ta sikte på å unngå falskt negative resultater. Screeningmetoder kan omfatte bioanalytiske metoder og GC-MS-metoder.

Med screeningmetoder sammenlignes analyseresultatet med en terskelverdi, noe som gir et ja/nei-svar på om grenseverdien eller tiltaksgrensen kan være overskredet. Konsentrasjonen av PCDD/PCDF og summen av PCDD/PCDF og dioksinlignende PCB i prøver som mistenkes for ikke å overholde grenseverdien, må bestemmes/bekreftes ved hjelp av en bekreftelsesmetode.

Bekreftelsesmetoder

Bekreftelsesmetoder gjør det mulig entydig å identifisere og mengdebestemme PCDD/PCDF og dioksinlignende PCB i en prøve og framskaffe fullstendige opplysninger på forbindelsesnivå. Disse metodene gjør det derfor mulig å kontrollere grenseverdiene og tiltaksgrensene, herunder bekrefte resultatene av screeningmetodene. Resultatene kan dessuten anvendes for andre formål, f.eks. å bestemme lave bakgrunnsnivåer ved overvåking av fôrvarer, følge utviklingstrekk over tid, vurdere eksponering og bygge opp en database for eventuelt å kunne vurdere tiltaksgrenser og grenseverdier på nytt. De er også viktige for å fastslå forbindelsesmønstre for å påvise kilden til en eventuell forurensning. Slike metoder omfatter bruk av GC-HRMS. GC-MS/MS kan også brukes til å bekrefte om grenseverdien er overholdt eller ikke.

Ved beregning av konsentrasjoner av toksisitetsekvivalenter (TEQ) skal konsentrasjonen av de enkelte stoffene i en gitt prøve multipliseres med sin respektive toksisitetsekvivalensfaktor (TEF) (se fotnote (1)* i kapittel I), og deretter summeres for å gi den samlede konsentrasjonen av dioksinlignende forbindelser uttrykt som TEQ.

I denne del B menes med godkjent særskilt grense for mengdebestemmelse av en enkeltforbindelse det laveste innholdet av analytten som kan måles med rimelig statistisk sikkerhet, og som oppfyller identifikasjonskriteriene som er beskrevet i internasjonalt anerkjente standarder, f.eks. i standarden EN 16215:2012 (Dyrefôr – Bestemmelse av dioksiner og dioksinliknende PCB ved GC/HRMS og av indikator-PCB ved GC/HRMS) og/eller i EPA-metode 1613 og 1668 som revidert.

konsentrasjonen av en analytt i det ekstraktet av en prøve som for de to forskjellige ionene som skal overvåkes, gir et instrumentsutslag med et signal/støy-forhold på 3:1 for det minst følsomme rådatasignalet, eller, dersom beregningen av signal/støy av tekniske årsaker ikke gir pålitelige resultater, punktet for laveste konsentrasjon i en kalibreringskurve som gir et akseptabelt (≤ 30 %) og konsekvent (målt minst i starten og på slutten av en analyseserie) avvik i forhold til den gjennomsnittlige relative responsfaktoren beregnet for alle punkter i kalibreringskurven i hver prøveserie. Grensen for mengdebestemmelse (LOQ) beregnes fra punktet for laveste konsentrasjon idet det tas hensyn til gjenfinning av interne standarder og prøvemengde.

Bioanalytiske screeningmetoder gir ikke resultater på forbindelsesnivå, men gir bare en indikasjon 1 på TEQ-nivået, uttrykt i bioanalytiske ekvivalenter (BEQ), der det tas hensyn til det faktum at ikke alle forbindelser i et prøveekstrakt som gir respons i analysen, oppfyller alle kravene i TEQ-prinsippet.

Screening- og bekreftelsesmetoder skal bare brukes til kontroll av en bestemt matriks dersom metodene er tilstrekkelig følsomme til å påvise nivåer ved tiltaksgrensen eller grenseverdien på en pålitelig måte.

1 Bioanalytiske metoder er ikke spesifikke for forbindelsene i TEF-systemet. I prøveekstraktet kan det også finnes andre strukturelt beslektede AhR-aktive forbindelser som kan bidra til samlet respons. Bioanalytiske resultater kan derfor ikke være et estimat, men snarere en indikasjon på TEQ-nivået i prøven.

Det skal treffes tiltak for å unngå krysskontaminering i alle trinn av prøvetakings- og analyseprosessen.

Prøvene skal oppbevares og transporteres i beholdere av glass, aluminium, polypropylen eller polyetylen som er egnet for oppbevaring uten at innholdet av PCDD/PCDF og dioksinlignende PCB i prøvene påvirkes. Spor av papirstøv skal fjernes fra prøvebeholderen.

Oppbevaring og transport skal foregå på en slik måte at fôrvareprøven bevares i uendret stand.

Om nødvendig skal hver laboratorieprøve finmales og blandes grundig ved hjelp av en metode som sikrer fullstendig homogenisering (f.eks. så finmalt at prøven kan siktes i en sikt med 1 mm maskevidde). Prøvene skal tørkes før de males dersom vanninnholdet er for høyt.

Det skal kontrolleres at reagenser, utstyr av glass og annet utstyr ikke kan påvirke de TEQ- eller BEQ-baserte resultatene.

Det skal utføres en blindanalyse ved å gjennomføre hele analyseprosessen, men uten prøven.

Ved bioanalytiske metoder skal det kontrolleres at alt utstyr av glass og løsemidler som brukes i analysene, ikke inneholder forbindelser som kan interferere med påvisningen av målforbindelser i måleområdet. Utstyr av glass skal skylles med løsemidler eller varmes opp til temperaturer som er tilstrekkelig høye til å fjerne spor av PCDD/PCDF, dioksinlignende forbindelser og interfererende forbindelser fra overflatene.

Prøvemengden som brukes til ekstraksjon, må være tilstrekkelig stor til å oppfylle kravene om et tilstrekkelig lavt måleområde, herunder grenseverdi- eller tiltaksgrensekonsentrasjonene.

De enkelte framgangsmåtene for tillaging av prøver som brukes for de aktuelle produktene, skal følge internasjonalt anerkjente retningslinjer.

I samsvar med bestemmelsene i forordning (EF) nr. 882/2004 skal laboratoriene være akkreditert av et godkjent organ som tilfredsstiller kravene i ISO Guide 58, for å sikre at de kvalitetssikrer sine analyser. Laboratoriene skal være akkreditert i henhold til standarden EN ISO/IEC 17025.

Laboratoriets kompetanse skal dokumenteres ved løpende, vellykket deltakelse i undersøkelser som foretas ved flere laboratorier, for å bestemme PCDD/PCDF og dioksinlignende PCB i relevante fôrmatrikser og konsentrasjonsområder.

Laboratorier som bruker screeningmetoder til rutinekontroll av prøver, skal ha et tett samarbeid med laboratorier som bruker bekreftelsesmetoden, både for kvalitetskontroll og for å bekrefte analyseresultatet for mistenkelige prøver.

Noen PCDD- og PCDF-forbindelser er ekstremt giftige, og de påviselige mengdene skal derfor ligge i det øvre femtogram-området (10–15 g). For de fleste PCB-forbindelser er det tilstrekkelig med en grense for mengdebestemmelse i nanogram-området (10–9 g). Ved måling av de mer giftige dioksinlignende PCB-forbindelsene (særlig non-orto-substituerte forbindelser) skal den nedre del av måleområdet nå de nedre pikogram-nivåene (10–12 g). For alle andre PCB-forbindelser er det tilstrekkelig med en grense for mengdebestemmelse i nanogram-området (10–9 g).

5.2. Høy selektivitet (spesifisitet)

Det må kunne skilles mellom PCDD, PCDF og dioksinlignende PCB og en rekke andre potensielt interfererende forbindelser som ekstraheres samtidig, og som forekommer i konsentrasjoner som kan være flere ganger høyere enn de relevante analyttenes. For GC-MS-metoder må det kunne skilles mellom ulike forbindelser, f.eks. mellom giftige (som de sytten 2,3,7,8-substituerte PCDD og PCDF og de tolv dioksinlignende PCB) og andre forbindelser.

Bioanalytiske metoder skal kunne påvise målforbindelser som summen av PCDD/PCDF og/eller dioksinlignende PCB. Ved rensing av prøven skal målet være å fjerne forbindelser som forårsaker falskt positive resultater, eller forbindelser som kan svekke responsen og dermed forårsake falskt negative resultater.

5.3. Høy nøyaktighet (riktighet og presisjon, påviselig gjenfinning i biologiske prøver)

For GC-MS-metoder skal bestemmelsen gi et pålitelig anslag over den faktiske konsentrasjonen i en prøve. Høy nøyaktighet er nødvendig for å unngå at et resultat av en analyse avvises fordi det bestemte TEQ-nivået ikke er tilstrekkelig pålitelig. Nøyaktighet uttrykkes som riktighet (differansen mellom den målte gjennomsnittsverdien for en analytt i et sertifisert materiale og dens sertifiserte verdi, uttrykt som en prosent av denne verdien) og presisjon (RSDR, det vil si relativt standardavvik beregnet ut fra resultater oppnådd under reproduserbare forhold).

For bioanalytiske metoder skal den påviselige gjenfinningen i biologiske prøver bestemmes. Med påviselig gjenfinning i biologiske prøver menes BEQ-nivået beregnet ut fra TCDD- eller PCB 126-kalibreringskurven korrigert for blindprøven og deretter delt på TEQ-nivået bestemt med bekreftelsesmetoden. Formålet er å korrigere for faktorer som tap av PCDD/PCDF og dioksinlignende forbindelser i ekstraksjons- og rensefasene, samtidig ekstraherte forbindelser som øker eller svekker responsen (agonistisk og antagonistisk virkning), kvaliteten på kurvetilpasningen eller forskjeller mellom verdiene for toksisitetsekvivalensfaktor (TEF) og relativ potens (REP). Påviselig gjenfinning i biologiske prøver beregnes ut fra egnede referanseprøver med representative forbindelsesmønstre rundt det relevante nivået.

5.4. Validering i grenseverdiområdet og alminnelige kvalitetskontrolltiltak

Laboratoriene skal dokumentere en metodes ytelse i grenseverdiområdet, f.eks. 0,5, 1 og 2 ganger grenseverdien, med en akseptabel variasjonskoeffisient for gjentatte analyser under validering og rutineanalysering.

Som interne kvalitetskontrolltiltak skal det foretas jevnlige blindkontroller og tilsetningsforsøk eller analysering av kontrollprøver (om mulig helst med sertifisert referansemateriale). Kvalitetskontrolldiagrammer for blindkontroller, tilsetningsforsøk eller analysering av kontrollprøver skal registreres og kontrolleres for å sikre at analyseytelsen oppfyller kravene.

5.5. Grense for mengdebestemmelse

For bioanalytiske screeningmetoder er det ikke påkrevd å fastsette en grense for mengdebestemmelse (LOQ), men det skal dokumenteres at metoden kan skille mellom blindprøve- og terskelverdien. Når et BEQ-nivå bestemmes, skal det fastsettes et rapporteringsnivå for å håndtere prøver som gir en respons under dette nivået. Det skal dokumenteres at rapporteringsnivået er forskjellig fra metodens blindprøver med en faktor på minst tre, med en respons under måleområdet. Det skal derfor beregnes ut fra prøver som har et innhold av målforbindelsene rundt det påkrevde minstenivået, og ikke ut fra et signal/støy-forhold eller en analyseblindprøve.

For bekreftelsesmetoder skal grensen for mengdebestemmelse (LOQ) være på ca. én femdel av grenseverdien.

For å sikre pålitelige resultater av bekreftelses- eller screeningmetoder skal følgende kriterier være oppfylt i grenseverdi- eller tiltaksgrenseområdet for henholdsvis TEQ- og BEQ-verdien, bestemt enten som samlet TEQ (summen av PCDD/PCDF og dioksinlignende PCB) eller separat for PCDD/PCDF og dioksinlignende PCB:

Screening med bioanalytiske eller fysisk-kjemiske metoder Bekreftelsesmetoder Andel falskt negative prøver 1 < 5 % Riktighet –20 % til +20 % Repeterbarhet (RSDr) < 20 % Intern reproduserbarhet (RSDR) < 25 % < 15 %

1 Med hensyn til grenseverdiene.

5.7. Særlige krav til screeningmetoder

Både GC-MS-metoder og bioanalytiske metoder kan brukes til screening. Ved bruk av GC-MS-metoder får fastsatt i nr. 6 anvendelse. For cellebaserte bioanalytiske metoder er det fastsatt særlige krav i nr. 7.

Laboratorier som bruker screeningmetoder for rutinekontroll av prøver, skal ha et tett samarbeid med laboratorier som bruker bekreftelsesmetoden.

Screeningmetodens ytelse skal kontrolleres i forbindelse med rutineanalyser ved hjelp av analysekvalitetskontroll og løpende metodevalidering. Det skal foreligge et løpende program for kontroll av negative resultater.

Ved rutinemessig screening skal 20 % av prøveekstraktene måles med og uten tilsetning av 2,3,7,8-TCDD ved grenseverdien eller tiltaksgrensen for å kontrollere om responsen eventuelt hemmes av interfererende stoffer i prøveekstraktet. Den målte konsentrasjonen i prøven med tilsetning skal sammenlignes med summen av konsentrasjonen i ekstraktet uten tilsetning og tilsetningskonsentrasjonen. Dersom den målte konsentrasjonen er mer enn 25 % lavere enn den beregnede konsentrasjonen (summen), tyder dette på at signalet kan være hemmet, og den aktuelle prøven skal da gjennomgå en bekreftende analyse med GC-HRMS. Resultatene skal overvåkes ved hjelp av kvalitetskontrolldiagrammer.

Om lag 2–10 % av de negative prøvene, avhengig av prøvematriks og laboratoriets erfaringsnivå, skal bekreftes med GC-HRMS.

Andelen falskt negative resultater fra screening av prøver som ligger under og over grenseverdien eller tiltaksgrensen, skal bestemmes. Den faktiske andelen falskt negative prøver skal være under 5 %. Når det foreligger minst 20 bekreftede resultater per matriks/matriksgruppe fra kvalitetskontrollen av negative prøver, skal disse opplysningene danne grunnlaget for å trekke konklusjoner om andelen falskt negative prøver. Resultater av prøver analysert ved ringprøving eller under forurensningshendelser som dekker et konsentrasjonsområde på opptil f.eks. to ganger grenseverdien, kan også tas med i de minst 20 resultatene som skal legges til grunn for vurderingen av andelen falskt negative prøver. Prøvene skal dekke de vanligste forbindelsesmønstrene og representere ulike kilder.

Selv om formålet med screeningprøver fortrinnsvis er å oppdage prøver som overskrider tiltaksgrensen, er det grenseverdien som er kriteriet for å bestemme andelen falskt negative prøver, idet det tas hensyn til bekreftelsesmetodens måleusikkerhet.

Potensielt positive prøver fra screeningen skal alltid kontrolleres ved å foreta en ny og fullstendig analysering av den opprinnelige prøven ved bruk av en bekreftelsesmetode. Disse prøvene kan også anvendes for å vurdere andelen falskt positive prøver. For screeningmetoder skal andelen falskt positive prøver være den andelen av resultatene som bekreftes som negative ved hjelp av en bekreftende analyse, selv om prøven i en tidligere screening er erklært som potensielt positiv. Vurderingen av hvor godt screeningmetoden fungerer skal baseres på en sammenligning av falskt positive prøver og det totale antall prøver som er undersøkt. Andelen skal være tilstrekkelig lav til at det lønner seg å bruke en screeningmetode.

Bioanalytiske metoder skal, i hvert fall under valideringsforhold, gi en gyldig indikasjon på TEQ-nivået, beregnet og uttrykt i BEQ.

Også for bioanalytiske metoder som gjennomføres under repeterbarhetsforhold, vil intern RSDr normalt være mindre enn RSDR (reproduserbarhet).

Differansen mellom øvre og nedre konsentrasjon skal ikke overskride 20 % ved bekreftelse av overskridelsen av grenseverdien eller, ved behov, tiltaksgrenser.

6.2. Gjenfinningskontroll

For å validere analysemetoden skal det tilsettes 13C-merkede 2,3,7,8-klorsubstituerte interne PCDD/PCDF-standarder og 13C-merkede interne dioksinlignende PCB-standarder helt i begynnelsen av analysemetoden, f.eks. før ekstraksjon. Det skal tilsettes minst én forbindelse for hver av de tetra- til okta-klorerte homologe gruppene av PCDD/PCDF og minst én forbindelse for hver av de homologe gruppene av dioksinlignende PCB (og eventuelt minst én forbindelse for hver valgte massespektrometriske ioneregistreringsfunksjon som brukes til kontroll av PCDD/PCDF og dioksinlignende PCB). Når det gjelder bekreftelsesmetoder, skal alle de sytten 13C-merkede 2,3,7,8-substituerte interne PCDD/PCDF-standardene og alle de tolv 13C-merkede interne dioksinlignende PCB-standardene brukes.

Ved hjelp av relevante kalibreringsløsninger skal dessuten relative responsfaktorer bestemmes for de forbindelser som ikke tilsettes en 13C-merket analog.

For fôrvarer av vegetabilsk og animalsk opprinnelse som inneholder mindre enn 10 % fett, skal interne standarder tilsettes før ekstraksjon. For fôrvarer av animalsk opprinnelse som inneholder mer enn 10 % fett, skal de interne standardene tilsettes enten før eller etter ekstraksjonen av fett. Det skal foretas en hensiktsmessig validering av ekstraksjonseffektiviteten avhengig av i hvilken fase de interne standardene ble tilsatt, og av om resultatene er produkt- eller fettbaserte.

Før analysering med GC-MS skal det tilsettes én eller to gjenfinningsstandarder (surrogatstandarder).

Gjenfinningen må kontrolleres. For bekreftelsesmetoder skal gjenfinningen av de enkelte interne standardene ligge i området 60–120 %. For enkelte forbindelser, særlig visse hepta- og okta-klorerte dibenzo-p-dioksiner og dibenzofuraner, skal lavere eller høyere gjenfinning aksepteres, forutsatt at deres bidrag til TEQ-verdien ikke utgjør mer enn 10 % av den samlede TEQ-verdien (basert på summen av PCDD/PCDF og dioksinlignende PCB). Ved bruk av GC-MS-screeningmetoder skal gjenfinningen ligge i området 30–140 %.

PCDD/PCDF skal separeres fra interfererende klorerte forbindelser som ikke-dioksinlignende PCB og klorerte difenyletere ved hjelp av egnede kromatografiteknikker (fortrinnsvis med florisil-, aluminiumoksid- og/eller karbonkolonne).

Gasskromatografisk separasjon av isomerer skal være < 25 % fra topp til topp mellom 1,2,3,4,7,8-HxCDF og 1,2,3,6,7,8-HxCDF.

Kalibreringskurveområdet skal dekke det relevante grenseverdi- eller tiltaksgrenseområdet.

GC-HRMS: Ved HRMS skal oppløsningen normalt være høyere enn eller lik 10 000 for hele masseområdet ved 10 % valley. Ytterligere identifikasjons- og bekreftelseskriterier beskrevet i internasjonalt anerkjente standarder, for eksempel i standarden EN 16215:2012 (Dyrefôr – Bestemmelse av dioksiner og dioksinliknende PCB ved GC/HRMS og av indikator-PCB ved GC/HRMS) og/eller i EPA-metode 1613 og 1668 som revidert, skal oppfylles. GC-MS/MS: Kontroll av minst to bestemte morioner, hver med ett særskilt tilsvarende datterion fra overgangen, for alle merkede og umerkede analytter innenfor analysens virkeområde. Høyeste tillatte toleranse for relativ ioneintensitet på ± 15 % for utvalgte datterioner fra overgangen sammenlignet med beregnede eller målte verdier (gjennomsnittet av kalibreringsstandarder) ved identiske MS/MS-forhold, særlig kollisjonsenergi og kollisjonsgasstrykk, for hver overgang av en analytt. Oppløsningen for hver kvadrupol skal minst være lik eller bedre enn enhetsmasseoppløsningen (enhetsmasseoppløsning: tilstrekkelig oppløsning til å skille to topper i en masseenhet) for å gjøre mulig interferens med de relevante analyttene så liten som mulig. Ytterligere kriterier beskrevet i internasjonalt anerkjente standarder, for eksempel i standarden EN 16215:2012 (Dyrefôr – Bestemmelse av dioksiner og dioksinliknende PCB ved GC/HRMS og av indikator-PCB ved GC/HRMS) og/eller i EPA-metode 1613 og 1668 som revidert, skal oppfylles, unntatt plikten til å bruke GC-HRMS.

Bioanalytiske metoder er metoder basert på bruk av biologiske prinsipper som cellebaserte analyser, reseptoranalyser eller immunologiske analyser. Her i nr. 7 fastsettes allmenne krav til bioanalytiske metoder.

I en screeningmetode klassifiseres i prinsippet en prøve som negativ eller mistenkt positiv. I denne forbindelse sammenlignes det beregnede BEQ-nivået med terskelverdien (se nr. 7.3). Prøver under terskelverdien erklæres som negative, og prøver som er lik eller over terskelverdien er mistenkt positive og må analyseres med en bekreftelsesmetode. I praksis kan et BEQ-nivå som tilsvarer 2/3 av grenseverdien fungere som terskelverdi, forutsatt at andelen falskt negative prøver er på under 5 %, og at andelen falskt positive prøver er akseptabel. Med særskilte grenseverdier for PCDD/PCDF og for summen av PCDD/PCDF og dioksinlignende PCB kreves det hensiktsmessige terskelverdier for biologiske prøver av PCDD/PCDF for å kunne kontrollere prøvens samsvar uten fraksjonering. For kontroll av prøver som overskrider tiltaksgrensene, kan en egnet prosentandel av den respektive tiltaksgrensen fungere som terskelverdi.

Når det gjelder visse bioanalytiske metoder, kan det dessuten fastsettes et veiledende nivå uttrykt i BEQ for prøver i måleområdet som overskrider rapporteringsgrensen (se nr. 7.1.1 og 7.1.6)

7.1. Vurdering av analyseresponsen

Ved beregning av konsentrasjonene ut fra en TCDD-kalibreringskurve vil verdiene i nedre og øvre del av kurven vise stor variasjon (høy variasjonskoeffisient). Måleområdet er området der variasjonskoeffisienten er lavere enn 15 %. Den nedre delen av måleområdet (rapporteringsgrensen) settes høyere enn metodens blindprøver med en faktor på minst 3. Den øvre delen av måleområdet er normalt representert ved en EC70-verdi (70 % av høyeste effektive konsentrasjon), men er lavere dersom variasjonskoeffisienten er høyere enn 15 % i dette området. Måleområdet skal fastsettes under valideringen. Terskelverdiene (se nr. 7.3) skal ligge godt innenfor måleområdet. Standardløsninger og prøveekstrakter skal minst analyseres i duplikater. Ved bruk av duplikater skal en standardløsning eller et kontrollekstrakt som er analysert i 4–6 brønner fordelt over platen, gi en respons eller en konsentrasjon (bare mulig i måleområdet) basert på en variasjonskoeffisient på < 15 %

7.1.2. Kalibrering

Innholdet i prøver skal beregnes ved å sammenligne analyseresponsen med en TCDD-kalibreringskurve (eller PCB 126 eller en standardblanding av PCDD/PCDF/dioksinlignende PCB) for å beregne BEQ-nivået i ekstraktet og deretter i prøven. Kalibreringskurvene skal inneholde 8–12 konsentrasjoner (minst i duplikater) med tilstrekkelige konsentrasjoner i den nedre delen av kurven (måleområdet). Det skal legges særlig vekt på kvaliteten på kurvetilpasningen i måleområdet. Når tilpasningsgraden ved ikke-lineær regresjon skal bedømmes, har R2-verdien liten eller ingen betydning. En bedre tilpasning oppnås ved å redusere differansen mellom beregnede og observerte nivåer i kurvens måleområde, f.eks. ved å redusere residualkvadratsummen til et minimum. Beregnet innhold i prøveekstraktet korrigeres deretter for BEQ-nivået som er beregnet for en matriks- eller løsemiddelblindprøve (for å ta hensyn til urenheter fra løsemidler og kjemiske stoffer som er brukt), og for den påviselige gjenfinningen (beregnet ut fra BEQ-nivået i egnede referanseprøver med representative forbindelsesmønstre rundt grenseverdien eller tiltaksgrensen). Når det korrigeres for gjenfinning, skal den påviselige gjenfinningen alltid være innenfor påkrevd område (se nr. 7.1.4). Referanseprøver som brukes for å korrigere for gjenfinning, må overholde kravene angitt i nr. 7.2.

En kalibreringskurve framstilt av minst fire referanseprøver (se nr. 7.2.4: en matriksblindprøve og tre referanseprøver på 0,5, 1,0 og 2,0 ganger grenseverdien eller tiltaksgrensen) kan brukes, noe som fjerner behovet for å korrigere for blindprøve og gjenfinning. I slike tilfeller kan analyseresponsen som tilsvarer 2/3 av grenseverdien (se nr. 7.3), beregnes direkte fra disse prøvene og brukes som terskelverdi. For kontroll av prøver som overskrider tiltaksgrensene, vil en egnet prosentandel av disse tiltaksgrensene være en egnet terskelverdi.

Ekstraktene kan deles opp i fraksjoner som inneholder PCDD/PCDF og dioksinlignende PCB, slik at TEQ-nivået for PCDD/PCDF og dioksinlignende PCB kan angis hver for seg (i BEQ). Det skal fortrinnsvis brukes en PBC 126-standardkalibreringskurve til å vurdere resultatene for fraksjonen som inneholder dioksinlignende PCB.

«Påviselig gjenfinning i biologiske prøver» skal beregnes ut fra egnede referanseprøver med representative forbindelsesmønstre rundt grenseverdien eller tiltaksgrensen, og uttrykkes som en prosent av BEQ-nivået sammenlignet med TEQ-nivået. Avhengig av analysetype og hvilke TEF-verdier 1 som er brukt, kan forskjellene mellom TEF- og REP-faktorene for dioksinlignende PCB forårsake lav påviselig gjenfinning for dioksinlignende PCB sammenlignet med PCDD/PCDF. Dersom det utføres en separat bestemmelse av PCDD/PCDF og dioksinlignende PCB, skal den påviselige gjenfinningen i biologiske prøver derfor være 20–60 % for dioksinlignende PCB og 50–130 % for PCDD/PCDF (områdene gjelder for TCDD-kalibreringskurven). Ettersom bidraget fra dioksinlignende PCB til summen av PCDD/PCDF og dioksinlignende PCB kan variere mellom ulike matrikser og prøver, avspeiler den påviselige gjenfinningen i biologiske prøver for summen av PCDD/PCDF og dioksinlignende PCB disse områdene og skal være på 30–130 %. Dersom TEF-verdiene for PCDD/PCDF og dioksinlignende PCB i unionsregelverket endres vesentlig, må disse områdene revideres.

Tapet av forbindelser under rensing skal kontrolleres under validering. En blindprøve tilsatt en blanding av ulike forbindelser skal gjennomgå rensing (minst n = 3), og gjenfinning og variabilitet skal kontrolleres med en bekreftelsesmetode. Gjenfinningen skal være i området 60–120 %, særlig for forbindelser som bidrar med mer enn 10 % til TEQ-nivået i de ulike blandingene.

Ved rapportering av BEQ-nivåer skal det fastsettes en rapporteringsgrense ut fra relevante matriksprøver med typiske forbindelsesmønstre, men ikke ut fra standardenes kalibreringskurve, ettersom presisjonen er lav i den nedre delen av kurven. Det skal tas hensyn til virkningene av ekstraksjon og rensing. Rapporteringsgrensen skal settes høyere enn metodens blindprøver med en faktor på minst 3.

7.2. Bruk av referanseprøver

Referanseprøvene skal representere prøvematriks, forbindelsesmønstre og konsentrasjonsområder for PCDD/PCDF og dioksinlignende PCB rundt grenseverdien eller tiltaksgrensen.

En matriksblindprøve, eller dersom dette ikke er mulig, en metodeblindprøve og en referanseprøve ved grenseverdien eller tiltaksgrensen skal inngå i hver analyseserie. Prøvene skal ekstraheres og analyseres samtidig under identiske forhold. For å sikre at analysen er egnet skal referanseprøven vise en klart høyere respons enn blindprøven. Disse prøvene kan brukes til å korrigere for blindprøver og gjenfinning.

Referanseprøver som er valgt ut for å korrigere for gjenfinning, skal være representative for alle analyseprøver, slik at forbindelsesmønstre ikke kan føre til at nivåene undervurderes.

Det kan tas med ekstra referanseprøver med en konsentrasjon på f.eks. 0,5 og 2,0 ganger grenseverdien eller tiltaksgrensen for å påvise analysens effektivitet innenfor det området som er relevant for kontrollen av grenseverdien eller tiltaksgrensen. Kombinert kan disse prøvene brukes til å beregne BEQ-nivået i analyseprøvene (se nr. 7.1.2.2)

Forholdet mellom bioanalytiske resultater i BEQ og resultater fra bekreftelsesmetoden i TEQ skal fastsettes (f.eks. gjennom matrikstilpassede kalibreringsforsøk med referanseprøver tilsatt 0, 0,5, 1 og 2 ganger grenseverdien, med seks repetisjoner på hvert nivå (n = 24)). Korreksjonsfaktorer (blindprøve og gjenfinning) kan beregnes ut fra dette forholdet, men dette skal kontrolleres i samsvar med nr. 7.2.2.

Det skal fastsettes terskelverdier for å kunne avgjøre om en prøve overholder grenseverdiene, eller, dersom det er relevant, for å kontrollere tiltaksgrensene i forhold til de gjeldende grenseverdier eller tiltaksgrenser som er fastsatt for enten PCDD/PCDF og dioksinlignende PCB hver for seg, eller for summen av PCDD/PCDF og dioksinlignende PCB. De representeres av det nedre endepunktet i fordelingen av bioanalytiske resultater (korrigert for blindprøve og gjenfinning), som tilsvarer beslutningsgrensen for bekreftelsesmetoden basert på et konfidensintervall på 95 %, noe som innebærer en andel falskt negative prøver på < 5 % og et RSDR på < 25 %. Beslutningsgrensen for bekreftelsesmetoden er grenseverdien, idet det tas hensyn til måleusikkerheten.

Terskelverdien (i BEQ) kan beregnes på en av måtene beskrevet i nr. 7.3.1, 7.3.2 og 7.3.3 (se figur 1):

Ved bruk av det nedre båndet i prediksjonsintervallet på 95 % ved beslutningsgrensen for bekreftelsesmetoden:

Terskelverdi = der BEQDL BEQ som tilsvarer beslutningsgrensen for bekreftelsesmetoden, som er grenseverdien idet det tas hensyn til måleusikkerheten s y,x standard restavvik t α,f = m-2 Student-t-faktor (α = 5 %, f = frihetsgrader, ensidige) m samlet antall kalibreringspunkter (indeks j) n antall repetisjoner på hvert nivå x i prøvekonsentrasjon (i TEQ) for kalibreringspunktet i fastsatt med en bekreftelsesmetode x gjennomsnitt av konsentrasjonene (i TEQ) for alle kalibreringsprøver kvadratsumparameter, i = indeks for kalibreringspunkt i

Beregning ut fra bioanalytiske resultater (korrigert for blindprøve og gjenfinning) av flere analyser av prøver (n ≥ 6) forurenset ved bekreftelsesmetodens beslutningsgrense, som nedre endepunkt for fordeling av data ved tilsvarende gjennomsnittsverdi for BEQ:

Terskelverdi = BEQDL – 1,64 × SDR der SDR standardavvik for resultater av biologiske prøver ved BEQDL, målt ved interne reproduserbarhetsforhold

Beregning som gjennomsnittsverdi av bioanalytiske resultater (i BEQ, korrigert for blindprøve og gjenfinning) av flere analyser av prøver (n ≥ 6) forurenset ved 2/3 av grenseverdien eller tiltaksgrensen, basert på den observasjon at dette nivået vil ligge rundt terskelverdien som er bestemt i henhold til nr. 7.3.1 eller 7.3.2.

Bioanalytiske resultater (BEQ ) – BEQ beslutningsgrense – Regresjonslinje med 95 % prediksjonsintervall – Terskelverdi – BEQ Tiltaksgrense – Tiltaksgrense – Grenseverdi – Beslutningsgrense – HRGC/HRMS-resultater (TEQ)

Fra det nedre båndet i prediksjonsintervallet på 95 % ved beslutningsgrensen for bekreftelsesmetoden. Fra flere analyser av prøver (n ≥ 6) som er forurenset ved beslutningsgrensen for bekreftelsesmetoden, som nedre endepunkt for fordeling av data (representert ved en klokkeformet kurve i figuren) ved tilsvarende gjennomsnittsverdi for BEQ.

BEQ-baserte terskelverdier beregnet ut fra RSDR som ble bestemt under valideringen ved hjelp av et begrenset antall prøver med ulike matriks-/forbindelsesmønstre, kan være høyere enn de TEQ-baserte grenseverdiene eller tiltaksgrensene, ettersom det oppnås høyere presisjon enn det som er mulig å oppnå i rutineanalyser, når et ukjent spektrum av mulige forbindelsesmønstre må kontrolleres. I slike tilfeller skal terskelverdier beregnes ut fra et RSDR på 25 % eller helst på 2/3 av grenseverdien eller tiltaksgrensen.

7.4. Ytelsesegenskaper

Ettersom det ikke kan brukes interne standarder i bioanalytiske metoder, skal disse metodenes repeterbarhet analyseres for å innhente opplysninger om standardavviket innenfor og mellom de enkelte analyseseriene. Repeterbarheten skal være under 20 % og intern reproduserbarhet skal være under 25 %. Dette skal baseres på beregnet innhold uttrykt i BEQ, etter korrigering for blindprøve og gjenfinning.

Som en del av valideringsprosessen skal analysen vise at metoden kan skille mellom en blindprøve og et nivå ved terskelverdien, slik at prøver over den aktuelle terskelverdien kan identifiseres (se nr. 7.1.2).

Målforbindelser, mulig interferens og høyeste tolererte blindprøvenivåer skal fastsettes.

Standardavviket i responsen eller konsentrasjonen beregnet ut fra responsen (bare mulig i måleområdet) ved en tredobbel bestemmelse av et prøveekstrakt skal ikke overskride 15 %.

De ukorrigerte resultatene av referanseprøvene, uttrykt i BEQ (blindprøve og ved grenseverdien eller tiltaksgrensen), skal brukes til å vurdere den bioanalytiske metodens ytelse i et konstant tidsrom.

Kvalitetskontrolldiagrammer for metodens blindprøver og for hver type referanseprøve skal registreres og kontrolleres for å sikre at den analytiske ytelsen er i samsvar med kravene, særlig for metodens blindprøver med hensyn til den nødvendige minstedifferansen til nedre del av måleområdet og for referanseprøvene med hensyn til intern reproduserbarhet. Metodens blindprøver skal kontrolleres på en måte som gjør at man unngår falskt negative resultater når de trekkes fra.

Resultatene av mistenkelige prøver som er oppnådd med bekreftelsesmetodene, og 2–10 % av de negative prøvene (minst 20 prøver per matriks) skal samles inn og brukes til å vurdere screeningmetodens ytelse og forholdet mellom BEQ og TEQ. Disse opplysningene kan brukes ved ny vurdering av terskelverdiene som får anvendelse på rutineprøver for de validerte matriksene.

At en metode har god ytelse, kan også dokumenteres ved deltakelse i ringprøving. Resultatene av prøver analysert ved ringprøving som dekker et konsentrasjonsområde på opptil f.eks. to ganger grenseverdien, kan tas med i vurderingen av andelen falskt negative prøver dersom et laboratorium kan dokumentere god ytelse. Prøvene skal dekke de vanligste forbindelsesmønstrene og representere ulike kilder.

I forbindelse med hendelser kan terskelverdiene vurderes på nytt for å gjenspeile de særskilte matriks- og forbindelsesmønstrene i den aktuelle hendelsen.

1 Gjeldende krav er basert på TEF-verdiene publisert i: M. Van den Berg et al., Toxicol Sci 93 (2), 223-241 (2006).

8.1. Bekreftelsesmetoder

I den grad den benyttede analysemetoden gjør det mulig, skal analyseresultatene omfatte innholdet av de enkelte PCDD-/PCDF- og dioksinlignende PCB-forbindelsene og rapporteres som nedre og øvre konsentrasjoner og mellomkonsentrasjoner, slik at resultatrapporten inneholder flest mulig opplysninger, og slik at resultatene kan tolkes i henhold til bestemte krav.

Rapporten skal angi hvilken metode som er brukt til ekstraksjon av PCDD/PCDF og dioksinlignende PCB.

Gjenfinningsgraden for de enkelte interne standarder skal angis dersom den ligger utenfor området angitt i nr. 6.2.5, dersom grenseverdien er overskredet (i så fall gjenfinningsgraden for én av de to duplikatene), og i andre tilfeller på anmodning.

Ettersom det skal tas hensyn til måleusikkerheten når det avgjøres om en prøve oppfyller kravene, skal denne parameteren angis. Analyseresultatene skal derfor rapporteres som x +/– U, der x er analyseresultatet og U er den utvidede måleusikkerheten ved bruk av en dekningsfaktor på 2, noe som gir et konfidensintervall på ca. 95 %. Dersom PCDD/PCDF og dioksinlignende PCB bestemmes hver for seg, skal summen av den beregnede utvidede usikkerheten for de separate analyseresultatene for PCDD/PCDF og dioksinlignende PCB brukes som summen av PCDD/PCDF og dioksinlignende PCB.

Dersom det tas hensyn til måleusikkerheten ved å bruke CCα (som beskrevet i kapittel I nr. 2.2 i denne del B), skal denne parameteren rapporteres.

Resultatene skal angis i samme enheter og med minst samme antall signifikante sifre som grenseverdiene fastsatt i direktiv 2002/32/EF.

8.2. Bioanalytiske screeningmetoder

Resultatet av screeningen skal angis som enten «negativ» eller «mistenkt positiv» («mistenkt»).

I tillegg kan resultatet for PCDD//PCDF og/eller dioksinlignende PCB uttrykt i bioanalytiske ekvivalenter (BEQ, ikke TEQ) angis.

Prøver med en respons under rapporteringsgrensen skal angis som «under rapporteringsgrensen».

For hver type prøvematriks skal rapporten inneholde opplysninger om grenseverdien eller tiltaksgrensen vurderingen er bygget på.

Rapporten skal inneholde opplysninger om hvilken analyse som er anvendt, de grunnleggende analyseprinsippene og kalibreringstypen.

Rapporten skal angi hvilken metode som er brukt til ekstraksjon av PCDD/PCDF og dioksinlignende PCB.

Ved prøver som mistenkes for å være positive, må rapporten inneholde en merknad om tiltak som skal treffes. Konsentrasjonen av PCDD/PCDF og summen av PCDD/PCDF og dioksinlignende PCB i prøver med forhøyet innhold skal bestemmes/bekreftes med en bekreftelsesmetode.

Kravene fastsatt i dette kapittel får anvendelse når fôrvarer analyseres med henblikk på offentlig kontroll av innholdet av ikke-dioksinlignende polyklorerte bifenyler (ikke-dioksinlignende PCB) og andre forskriftsmessige formål.

Gasskromatografi/elektronaffinitetsdetektor (GC-ECD), GC-LRMS, GC-MS/MS, GC-HRMS eller lignende metoder.

Relativ retensjonstid med hensyn til interne standarder eller referansestandarder (akseptabelt avvik på +/– 0,25 %).

Gasskromatografisk separasjon av alle seks indikator-PCB (PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 138, PCB 153 og PCB 180) fra interfererende stoffer, særlig PCB som elueres samtidig, særlig når innholdet i prøvene ligger innenfor de lovfestede grenseverdiene, og det skal bekreftes at prøven ikke er i samsvar med kravene.

[Forbindelser som ofte elueres samtidig, er f.eks. PCB 28/31, PCB 52/69 og PCB 138/163/164. Når det gjelder GC-MS, skal det tas hensyn til eventuell interferens fra fragmenter av høyklorerte forbindelser.]

to særskilte ioner for HRMS, to særskilte ioner med m/z > 200 eller tre særskilte ioner med m/z > 100 for LRMS, ett morion og to datterioner for MS-MS.

Høyeste tillatte toleranse for isotopforhold for utvalgte massefragmenter:

Relativt avvik i isotopforhold for utvalgte massefragmenter fra teoretisk isotopforhold eller kalibreringsstandard for målionet (det hyppigst forekommende av de målte ioner) og bekreftelsesion(er): Bekreftelsesionets relative intensitet sammenlignet med målionets GC-EI-MS (relativt avvik) GC-CI-MS, GC-MS n (relativt avvik) > 50 % ± 10 % ± 20 % > 20–50 % ± 15 % ± 25 % > 10–20 % ± 20 % ± 30 % ≤ 10 % ± 50 % 1 ± 50 % 1

1 Ettersom det finnes et tilstrekkelig antall massefragmenter med relativ intensitet > 10 %, bør man ikke anvende bekreftelsesioner med en relativ intensitet < 10 % i forhold til målionet.

Resultater som overskrider toleransegrensen, skal bekreftes med to GC-kolonner med stasjonære faser med ulik polaritet.

Metodens ytelse skal valideres innenfor grenseverdiområdet (0,5 til 2 ganger grenseverdien) med en godkjent variasjonskoeffisient for gjentatte analyser (se krav til intermediær presisjon i nr. 9).

Blindprøveverdiene skal ikke være høyere enn 30 % av forurensingsnivået som tilsvarer grenseverdien. 1

1 Det anbefales på det sterkeste at bidraget fra reagensblindprøven er så lite som mulig sammenlignet med innholdet av et forurensende stoff i en prøve. Det er laboratoriets ansvar å kontrollere hvordan innholdet i blindprøvene varierer, særlig når blindprøveinnholdet trekkes fra.

Regelmessige blindprøvekontroller, analysering av prøver med tilsetning, kvalitetskontrollprøver, deltakelse i undersøkelser av relevante matrikser som foretas ved flere laboratorier.

Bruk av egnede interne standarder med fysisk-kjemiske egenskaper som kan sammenlignes med de relevante analyttenes.

Tilsetning av interne standarder:

Tilsetning til produkter (før ekstraksjon og rensing).

resultatene skal korrigeres for gjenfinning av interne standarder, gjenfinningsprosenten for isotopmerkede interne standarder skal være på mellom 50 og 120 %, lavere eller høyere gjenfinning for enkeltforbindelser med et bidrag til summen av de seks indikator-PCB på under 10 % er akseptabelt.

gjenfinning av interne standarder skal kontrolleres for hver prøve, gjenfinningsprosenten for interne standarder skal være på mellom 60 og 20 %, resultatene skal korrigeres for gjenfinning av interne standarder.

Gjenfinningen av umerkede forbindelser skal kontrolleres ved hjelp av prøver med tilsetning eller kvalitetskontrollprøver med konsentrasjoner i grenseverdiområdet. Gjenfinningsprosenten for disse forbindelsene skal anses som akseptabel dersom den er på mellom 70 og 120 %.

I samsvar med bestemmelsene i forordning (EF) nr. 882/2004 skal laboratoriene være akkreditert av et godkjent organ som tilfredsstiller kravene i ISO Guide 58, for å sikre at de kvalitetssikrer sine analyser. Laboratoriene skal være akkreditert i henhold til standarden EN ISO/IEC 17025.

Riktighet –30 til +30 % Intermediær presisjon (RSD %) ≤ 20 % Differanse mellom øvre og nedre konsentrasjon (beregnet) ≤ 20 %

I den grad den benyttede analysemetoden gjør det mulig, skal analyseresultatene omfatte innholdet av de enkelte PCB-forbindelser og rapporteres som nedre og øvre konsentrasjoner og mellomkonsentrasjoner, slik at resultatrapporten inneholder flest mulig opplysninger, og slik at resultatene kan tolkes i henhold til bestemte krav.

I rapporten skal det også angis hvilken metode som er brukt ved ekstraksjon av PCB og lipider.

Gjenfinningsprosenten for de enkelte interne standarder skal angis dersom den ligger utenfor området angitt i nr. 7, dersom grenseverdien er overskredet, og i andre tilfeller på anmodning.

Ettersom det skal tas hensyn til måleusikkerheten når det avgjøres om en prøve oppfyller kravene, skal denne parameteren angis. Analyseresultatene skal derfor rapporteres som x +/– U, der x er analyseresultatet og U er den utvidede måleusikkerheten ved bruk av en dekningsfaktor på 2, noe som gir et konfidensintervall på ca. 95 %.

Dersom det tas hensyn til måleusikkerheten ved å bruke CCα (som beskrevet i kapittel I nr. 2.1), skal denne parameteren rapporteres.

Resultatene skal angis i samme enheter og med minst samme antall signifikante sifre som grenseverdiene fastsatt i direktiv 2002/32/EF. ◄ M4

Vedlegg VI til forordning (EF) nr. 152/2009 skal lyde:

► M2

Vedlegg VI Analysemetoder for bestemmelse av bestanddeler av animalsk opprinnelse for offentlig kontroll av fôr

1. Formål og virkeområde

I samsvar med bestemmelsene fastsatt i dette vedlegget skal bestemmelse av bestanddeler av animalsk opprinnelse i fôr utføres med lysmikroskopi eller polymerasekjedereaksjon (PCR).

Disse to metodene gjør det mulig å påvise forekomsten av bestanddeler av animalsk opprinnelse i fôrmidler og fôrblandinger. Med disse metodene er det imidlertid ikke mulig å beregne mengden slike bestanddeler i fôrmidler og fôrblandinger. Begge metodene har en påvisningsgrense på under 0,1 % vektprosent.

PCR-metoden gjør det mulig å identifisere den taksonomiske gruppen for de bestanddeler av animalsk opprinnelse som forekommer i fôrmidler og fôrblandinger.

Disse metodene skal anvendes når det kontrolleres at forbudene som er fastsatt i artikkel 7 nr. 1 i og vedlegg IV til forordning (EF) nr. 999/2001 og i artikkel 11 nr. 1 i forordning (EF) nr. 1069/2009, overholdes.

Avhengig av hvilken type fôr som skal prøves, kan disse metodene benyttes innenfor en enkelt protokoll, enten alene eller kombinert med hverandre, i samsvar med de standardiserte framgangsmåtene (SOP) som er fastsatt av EU-referanselaboratoriet for animalske proteiner i fôrvarer (EURL-AP) og offentliggjort på laboratoriets nettsted. 1

1 http://eurl.craw.eu

2. Metoder

2.1 Lysmikroskopi

Bestanddelene av animalsk opprinnelse som kan forekomme i fôrmidler og fôrblandinger som er sendt inn for analyse, identifiseres på grunnlag av typiske kjennetegn som kan identifiseres med mikroskop, som muskelfibrer og andre kjøttpartikler, brusk, bein, horn, hår, bust, blod, fjør, eggeskall, fiskebein og -skjell.

2.1.2. Reagenser og utstyr

Reagenser

Konsentreringsmiddel

Tetrakloretylen (spesifikk vekt 1,62)

Fargingsreagens

Alizaron-løsning (spe ut 2,5 ml 1M saltsyre med 100 ml vann og tilsett 200 mg alizaron til denne løsningen)

Monteringsmiddel

Lut (NaOH 2,5 % w/v eller KOH 2,5 % w/v)

Glyserol (ufortynnet, viskositet: 1490 cP)

Norland ® Optical Adhesive 65 (viskositet: 1200 cP) eller harpiks med tilsvarende egenskaper for tillaging av permanente objektglass

Monteringsmiddel med fargingsegenskaper

Lugol-løsning (løs opp 2 g kaliumjodid i 100 ml vann og tilsett 1 g jod under hyppig risting)

Cystin-reagens (2 g blyacetat, 10 g NaOH/100 ml vann)

Fehlings væske (klargjort før bruk med like deler (1/1) av to stamløsninger A og B. Løsning A: løs opp 6,9 g kobber (II) sulfatpentahydrat i 100 ml vann. Løsning B: løs opp 34,6 g natriumkaliumtartrat-tetrahydrat og 12 g NaOH i 100 ml vann)

Tetrametylbenzidin/hydrogenperoksid. (løs opp 1 g 3,3',5,5' tetrametylbenzidin (TMB) i 100 ml iseddik og 150 ml vann. Bland fire deler av denne TMB-løsningen med én del 3 % hydrogenperoksid før bruk)

Skyllemidler

Etanol ≥ 96 % (teknisk kvalitet)

Aceton (teknisk kvalitet)

Blekemiddel

Ferdigkjøpt løsning av natriumhypokloritt (9–14 % aktivt klor)

Utstyr

Analysevekt med en nøyaktighet på 0,001 g

Malingsutstyr: kvern eller morter

Sikter med kvadratiske masker med maskevidde på 0,25 mm og 1 mm

Konisk skilletrakt av glass med et volum på 250 ml, utstyrt med en stoppekran av teflon eller slipt glass i bunnen av kjeglen. Stoppekranens åpning skal ha en diameter på ≥ 4 mm. Et bunnfallsglassbeger med konisk bunn kan også brukes, forutsatt at laboratoriet har vist at påvisningsnivåene tilsvarer de som oppnås ved bruk av den koniske skilletrakten av glass.

Skilletrakt

Stereomikroskop med en forstørrelsesgrad på minst 6,5 × til 40 ×.

Sammensatt mikroskop med en forstørrelsesgrad på minst 100× til 400× og gjennomfallende lys. Polarisert lysmikroskopi og interferenskontrastmikroskopi kan også brukes.

Laboratorieglass av standardtype

Utstyr for tillaging av objektglass: Klassiske objektglass, objektglass med fordypning, dekkglass (20 × 20 mm), pinsett og liten spatel.

2.1.3. Prøvetaking og tillaging av prøver

Prøvetaking

Et representativt utvalg prøver, tatt i samsvar med bestemmelsene fastsatt i vedlegg I, skal anvendes.

Forholdsregler

For å unngå krysskontaminering på laboratoriet skal alt utstyr som skal brukes flere ganger, rengjøres grundig før bruk. Skilletrakten skal tas fra hverandre før rengjøring. Skilletraktens deler og glassvarer skal forvaskes for hånd og deretter vaskes i oppvaskmaskin. Sikter skal rengjøres med en børste med stiv, syntetisk bust. Det anbefales å rengjøre sikten en ekstra gang med aceton og trykkluft dersom den er brukt til fettholdig materiale som fiskemel.

Tillaging av andre prøver enn fett eller olje

Tørking av prøver: Prøver med et fuktighetsinnhold på > 14 % skal tørkes før håndtering.

Forhåndssikting av prøver: Det anbefales å sikte (maskevidde 1 mm) fôrvarer i pellets- eller kornform på forhånd, og deretter lage og analysere de to fraksjonene som to ulike prøver.

Delprøvetaking og maling: Minst 50 g av prøven skal brukes som delprøver for analyser og deretter males opp.

Ekstraksjon og tillaging av bunnfallet: Et parti på 10 g (med en nøyaktighet på 0,01 g) av den forhåndsmalte delprøven overføres til skilletrakten eller bunnfallsglassbegeret med konisk bunn og 50 ml tetrakloretylen tilsettes. Dersom det dreier seg om fiskemel eller andre rene animalske produkter, mineralingredienser eller premikser som skaper mer enn 10 % bunnfall, skal partiet som overføres til trakten, ikke være på mer enn 3 g. Blandingen ristes kraftig i minst 30 sekunder, og innsiden av trakten skylles forsiktig med minst 50 ml tetrakloretylen for å fjerne eventuelle partikler som har festet seg. Den nye blandingen skal stå i minst 5 minutter før bunnfallet skilles ut ved å åpne stoppekranen.

Dersom det brukes et bunnfallsglassbeger med konisk bunn, skal det røres godt i blandingen i minst 15 sekunder, og eventuelle partikler som har festet seg på sidene i glassbegeret, skal skylles forsiktig av innsiden med minst 10 ml ren tetrakloretylen. Blandingen skal stå i 3 minutter før den røres i på nytt i 15 sekunder. Eventuelle partikler som har festet seg på innsiden av glassbegeret, skal skylles forsiktig av med minst 10 ml ren tetrakloretylen. Den nye blandingen skal stå i minst 5 minutter før den flytende fraksjonen fjernes og kasseres ved omhyggelig dekantering slik at ingenting av bunnfallet går tapt.

Bunnfallet skal tørkes og deretter veies (med en nøyaktighet på 0,001 g). Dersom mer enn 5 % av bunnfallet består av partikler på > 0,50 mm, skal det siktes (maskevidde 0,25 mm) og de to fraksjonene skal undersøkes.

Ekstraksjon og tillaging av det flytende materialet: Etter at bunnfallet er framstilt med metoden beskrevet over, bør det finnes to faser i skilletrakten: en flytende som består av tetrakloretylen, og en fast fra det flytende materiale. Denne faste fasen er det flytende materialet, som framstilles ved at stoppekranen åpnes og all tetrakloretylen helles ut av trakten. Skilletrakten snus på hodet, og det flytende materialet overføres til en stor petriskål og lufttørkes i et avtrekksskap. Dersom mer enn 5 % av det flytende materialet består av partikler på > 0,50 mm, skal det siktes (maskevidde 0,25 mm) og de to fraksjonene skal undersøkes.

Tillaging av råstoff: Et parti på minst 5 g av den forhåndsmalte delprøven skal tillages. Dersom mer enn 5 % av materialet består av partikler på > 0,50 mm, skal det siktes (maskevidde 0,25 mm) og de to fraksjonene skal undersøkes.

Tillaging av prøver som består av fett eller olje

Dersom fettet er i fast form, skal det varmes opp i en ovn til det er flytende. 40 ml fett eller olje fra bunnen av prøven overføres med pipette til et sentrifugerør. Sentrifugeres i 10 minutter på 4000 omdreininger per minutt. Dersom fettet er i fast form etter sentrifugering, skal det varmes opp i en ovn til det er flytende. Gjenta sentrifugering i 5 minutter på 4000 omdreininger per minutt. Halvparten av de dekanterte urenhetene overføres med en liten skje eller en spatel til et objektglass for undersøkelse, glyserol anbefales som monteringsmiddel. De gjenværende urenhetene skal brukes til tillaging av bunnfallet som beskrevet i punkt 2.1.3.3.

Bruk av fargingsreagens

For å gjøre det lettere å identifisere bestanddelene av animalsk opprinnelse kan fargingsreagens brukes under tillaging av prøven i samsvar med retningslinjene utstedt av EURL-AP og offentliggjort på laboratoriets nettsted.

Det tørkede bunnfallet overføres til et reagensglass og skylles to ganger med rundt 5 ml etanol (blandes begge gangene med et Vortex blandeapparat i 30 sekunder, la løsemiddelet stå i omtrent halvannet minutt før det helles ut). Bunnfallet blekes ved å tilsette minst 1 ml natriumhypoklorittløsning. La reaksjonen fortsette i 10 minutter. Reagensglasset fylles med vann, bunnfallet skal stå i 2–3 minutter, og vann og svevende partikler helles forsiktig ut. Bunnfallet skal skylles to ganger til med rundt 10 ml vann (blandes begge gangene med et Vortex blandeapparat i 30 sekunder, la stå og hell ut vannet). Tilsett 2–10 dråper alizaron og bland løsningen med et Vortex blandeapparat. La reaksjonen pågå i 30 sekunder. Det fargede bunnfallet skylles først to ganger med omtrent 5 ml etanol og så én gang med aceton (blandes begge gangene med et Vortex blandeapparat i 30 sekunder, løsningen skal stå i omtrent 1 minutt og deretter helles ut). Det fargede bunnfallet tørkes.

2.1.4. Mikroskopisk undersøkelse

Tillaging av objektglass

Objektglass skal tillages av bunnfallet og, avhengig av laboranten, av enten det flytende materialet eller råstoffet. Dersom sikting er brukt ved tillaging av prøvene, skal begge fraksjonene (både den fine og den grove) tillages. Analyseprøver fra fraksjonene som fordeles på objektglassene, skal være representative for hele fraksjonen.

For å sikre at en komplett undersøkelsesprotokoll som fastsatt i 2.1.4.2 kan gjennomføres, skal det tillages et tilstrekkelig antall objektglass.

Objektglassene skal monteres med egnet monteringsmiddel i samsvar med de standardiserte framgangsmåtene (SOP) fastsatt av EURL-AP og offentliggjort på laboratoriets nettsted. Objektglassene skal være dekket av dekkglass.

Observasjonsprotokoller for påvisning av animalske partikler i fôrblandinger og fôrmidler

De tillagede objektglassene skal undersøkes i samsvar med observasjonsprotokollen fastsatt i diagram 1 for fôrblandinger og for andre fôrmidler enn rent fiskemel og i diagram 2 for rent fiskemel.

Mikroskopiundersøkelsene skal gjennomføres ved at det sammensatte mikroskopet brukes på bunnfallet og, avhengig av laboranten, enten på det flytende materialet eller på råstoffet. For de grove fraksjonene kan også stereomikroskop brukes i tillegg til det sammensatte mikroskopet. Hvert objektglass skal undersøkes i sin helhet med ulike grader av forstørring.

Det minste antallet av objektglass som skal undersøkes ved hvert trinn av observasjonsprotokollen, skal alltid overholdes, med mindre den samlede mengden av fraksjonsmateriale ikke gjør det mulig å nå det fastsatte antallet objektglass. Det skal ikke undersøkes flere enn seks objektglass per bestemmelse.

For å gjøre det enklere å identifisere partiklenes art og opprinnelse kan laboranten bruke hjelpemidler som system for beslutningsstøtte, bildesamlinger og referanseprøver.

Diagram 1

Observasjonsprotokoll for påvisning av animalske partikler i fôrblandinger og andre fôrmidler enn fiskemel

Diagram 2

Observasjonsprotokoll for påvisning av animalske partikler i fiskemel

Antall bestemmelser

Dersom det ikke påvises animalske partikler av en bestemt art (f.eks. landdyr eller fisk) etter en første bestemmelse utført i samsvar med observasjonsprotokollen fastsatt i enten diagram 1 eller diagram 2, er det ikke nødvendig med en ytterligere bestemmelse, og analyseresultatet skal rapporteres med bruk av ordlyden fastsatt i nr. 2.1.5.1.

Dersom det samlede antallet påviste animalske partikler av en bestemt art (f.eks. landdyr eller fisk) er fra 1–5 etter en første bestemmelse utført i samsvar med observasjonsprotokollen fastsatt i enten diagram 1 eller diagram 2, skal det gjennomføres en ny bestemmelse på en ny delprøve på 50 g. Dersom antallet påviste animalske partikler av en bestemt art er fra 0–5 etter denne andre bestemmelsen, skal analyseresultatet rapporteres med bruk av ordlyden fastsatt i nr. 2.1.5.2, hvis ikke skal en tredje bestemmelse gjennomføres på en ny delprøve på 50 g. Dersom summen av påviste partikler av en bestemt art er over 15 etter de to bestemmelsene, er det imidlertid ikke nødvendig med en ytterligere bestemmelse, og resultatet av analysen skal rapporteres direkte med bruk av ordlyden fastsatt i nr. 2.1.5.3. Dersom summen av påviste animalske partikler av en bestemt art er over 15 etter den tredje bestemmelsen, skal resultatet av analysen rapporteres med bruk av ordlyden fastsatt i nr. 2.1.5.3. Ellers rapporteres resultatet av analysen med bruk av ordlyden fastsatt i nr. 2.1.5.2.

Dersom det påvises flere enn 5 animalske partikler av en bestemt art (f.eks. landdyr eller fisk) etter en første bestemmelse utført i samsvar med observasjonsprotokollen fastsatt i enten diagram 1 eller diagram 2, skal analyseresultatet rapporteres med bruk av ordlyden fastsatt i nr. 2.1.5.3.

Når resultatene rapporteres, skal laboratoriet oppgi på hvilken type materiale analysen er utført på (bunnfall, flytende materiale eller råstoff) og hvor mange bestemmelser som er gjennomført.

Laboratorierapporten skal minst inneholde opplysninger om forekomsten av bestanddeler som stammer fra landdyr og fisk.

De ulike tilfellene skal rapporteres på følgende måte:

I den grad det har vært mulig å fastslå ved bruk av lysmikroskop, ble det ikke påvist bestanddeler som stammer fra landdyr i den innsendte prøven. I den grad det har vært mulig å fastslå ved bruk av lysmikroskop, ble det ikke påvist bestanddeler som stammer fra fisk i den innsendte prøven.

I den grad det har vært mulig å fastslå ved bruk av lysmikroskop, ble det i gjennomsnitt ikke påvist flere enn 5 partikler som stammer fra landdyr ved bestemmelse av den innsendte prøven. Partiklene ble identifisert som ... [bein, brusk, muskelvev, hår, horn ...]. Antall påviste partikler er under deteksjonsgrensen for mikroskopmetoden, og fare for falskt positivt resultat kan dermed ikke utelukkes. Eller, dersom relevant, I den grad det har vært mulig å fastslå ved bruk av lysmikroskop, ble det i gjennomsnitt ikke påvist flere enn 5 partikler som stammer fra fisk ved bestemmelse av den innsendte prøven. Partiklene ble identifisert som ... [fiskebein, fiskeskjell, brusk, muskelvev, otolitt, gjeller ... ]. Antall påviste partikler er under deteksjonsgrensen for mikroskopmetoden, og fare for falskt positivt resultat kan dermed ikke utelukkes.

Dersom prøven er siktet på forhånd, skal laboratorierapporten oppgi hvilken fraksjon (siktet fraksjon, pelletert fraksjon eller kjerner) de animalske partiklene er påvist i, ettersom påvisning av animalske partikler i bare den siktede fraksjonen kan være et tegn på forurensning fra omgivelsene.

I den grad det har vært mulig å fastslå ved bruk av lysmikroskop, ble det i gjennomsnitt påvist flere enn 5 partikler som stammer fra landdyr ved bestemmelse av den innsendte prøven. Partiklene ble identifisert som ... [bein, brusk, muskelvev, hår, horn ...]. Eller, dersom relevant, I den grad det har vært mulig å fastslå ved bruk av lysmikroskop, ble det i gjennomsnitt påvist flere enn 5 partikler som stammer fra fisk ved bestemmelse av den innsendte prøven. Partiklene ble identifisert som ... [fiskebein, fiskeskjell, brusk, muskelvev, otolitt, gjeller ... ].

Dersom prøven er siktet på forhånd, skal laboratorierapporten oppgi hvilken fraksjon (siktet fraksjon, pelletert fraksjon eller kjerner) de animalske partiklene er påvist i, ettersom påvisning av animalske partikler i bare den siktede fraksjonen kan være et tegn på forurensning fra omgivelsene.

2.2. PCR

Deoksyribonukleinsyre-fragment (DNA-fragment) av animalsk opprinnelse som kan forekomme i fôrmidler og fôrblandinger påvises ved en genetisk amplifikasjonsteknikk ved PCR som er rettet mot artsspesifikke DNA-sekvenser.

PCR-metoden krever at det først foretas en DNA-ekstraksjon. Deretter amplifiseres DNA-ekstraktet for å påvise de dyreartene som prøven omfattet.

2.2.2. Reagenser og utstyr

Reagenser

Reagenser for DNA-ekstraksjon

Bare reagenser som er godkjent av EURL-AP og offentliggjort på laboratoriets nettsted, skal brukes.

Reagenser for genetisk amplifisering

Primere og sonder

Det skal bare brukes primere og sonder med oligonukleotidsekvenser som er godkjent av EURL-AP. 1

Master Mix

Bare Master Mix-løsninger som ikke inneholder reagenser som kan føre til feil resultat på grunn av forekomst av animalsk DNA, skal brukes. 2

Dekontaminerings-reagenser

Saltsyreløsning (0,1 N)

Blekemiddel (løsning av natriumhypokloritt med 0,15 % aktivt klor)

Ikke-etsende reagenser for dekontaminering av kostbare enheter som analysevekter (f.eks. DNA EraseTM fra MP Biomedicals)

Utstyr

Analysevekt med en nøyaktighet på 0,001 g

Malingsutstyr

Termosykler for sanntids PCR

Mikrosentrifuge for mikrosentrifugerør

Sett med mikropipetter som gjør det mulig å overføre fra 1 μl opptil 1000 μl med pipette

Molekylærbiologisk standardutstyr i plast: mikrosentrifugerør, pipettespisser med filter til mikropipetter og plater som passer til termosykleren.

Frysere til lagring av prøver og reagenser

2.2.3. Prøvetaking og tillaging av prøver

Prøvetaking

Et representativt utvalg prøver, tatt i samsvar med bestemmelsene fastsatt i vedlegg I, skal anvendes.

Tillaging av prøven

Tillaging av laboratorieprøvene fram til DNA-ekstraksjon skal oppfylle kravene fastsatt i vedlegg II. Minst 50 g av prøven skal brukes som delprøver for analyser og deretter males opp.

Tillaging av prøven skal skje i et annet rom enn det som brukes til DNA-ekstraksjon og til genetiske amplifikasjonsreaksjoner som beskrevet i ISO 24276.

Det skal tillages to analyseprøver på minst 100 mg hver.

DNA-ekstraksjonen skal gjennomføres på hver tillagede analyseprøve i samsvar med de standardiserte framgangsmåtene (SOP) som er fastsatt av EURL-AP og offentliggjort på laboratoriets nettsted.

en blindprøve for ekstraksjon, en positiv kontroll for DNA-ekstraksjon.

Genetisk amplifisering skal gjennomføres ved hjelp av metodene som er godkjent for hver art som må identifiseres. Disse metodene er nedfelt i de standardiserte framgangsmåtene som er fastsatt av EURL-AP og offentliggjort på laboratoriets nettsted. Hvert DNA-ekstrakt skal analyseres ved minst to ulike konsentrasjoner for å vurdere hemming.

en positiv kontroll for mål-DNA skal brukes for hver plate eller serie av PCR-undersøkelse, en reagenskontroll for amplifiseringen (også kalt NTC for «no template control») skal brukes for hver plate eller serie av PCR-undersøkelser.

Når resultatene rapporteres, skal laboratoriet minst oppgi vekten på de analyseprøvene som er brukt, hvilke ekstraksjonsteknikker som er brukt, antall bestemmelser som er gjennomført og metodens påvisningsgrense.

Resultatene skal ikke tolkes og rapporteres dersom den positive DNA-ekstraksjonskontrollen og de positive DNA-målkontrollene ikke gir positive resultater for målet for undersøkelsen samtidig som reagenskontrollen for amplifiseringen er negativ.

Dersom resultatene fra de to analyseprøvene ikke stemmer overens, skal minst den genetiske amplifiseringen gjøres på nytt. Dersom laboratoriet har mistanke om at DNA-ekstraksjonen kan være årsaken til uoverensstemmelsen, skal en ny DNA-ekstraksjon og en påfølgende genetisk amplifisering gjennomføres før resultatene tolkes.

Den endelige framleggingen av resultatene skal bygge på integrering og tolking av resultatene fra de to analyseprøvene i samsvar med de standardiserte framgangsmåtene som er fastsatt av EURL-AP og offentliggjort på laboratoriets nettsted.

Negative resultater

Et negativt resultat skal rapporteres som følger:

Det ble ikke påvist DNA fra X i den innsendte prøven (der X er dyreart eller gruppen av dyrearter som er målet for forsøket).

Positive resultater

Et positivt resultat skal rapporteres som følger:

Det ble påvist DNA fra X i den innsendte prøven (der X er dyreart eller gruppen av dyrearter som er målet for forsøket).

1 Listen over nevnte primere og sonder for hver dyreart som prøven er rettet mot, er tilgjengelig på nettstedet til EURL-AP.

2 Eksempler på Master Mix som kan brukes, er tilgjengelig på nettstedet til EURL-AP. ◄ M2